Hantavirus infection: Insights into entry, assembly and pathogenesis

Hantaviruses (family Bunyaviridae, genus Hantavirus) are enveloped viruses incorporating a segmented, negative-sense RNA genome. Each hantavirus is carried by its specific host, either a rodent or an insectivore (shrew), in which the infection is asymptomatic and persistent. In humans, hantaviruses cause Hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Eurasia and Hantavirus cardiopulmonary syndrome (HCPS) in the Americas. In Finland, Puumala virus (genus Hantavirus) is the causative agent of NE, a mild form of HFRS. The HFRS-type diseases are often associated with renal failure and proteinuria that might be mechanistically explained by infected kidney tubular cell degeneration in patients. Previously, it has been shown that non-pathogenic hantavirus, Tula virus (TULV), could cause programmed cell death, apoptosis, in cell cultures. This suggested that the infected kidney tubular degeneration could be caused directly by virus replication. In the first paper of this thesis the molecular mechanisms involved in TULV-induced apoptosis was further elucidated. A virus replication-dependent down-regulation of ERK1/2, concomitantly with the induced apoptosis, was identified. In addition, this phenomenon was not restricted to TULV or to non-pathogenic hantaviruses in general since also a pathogenic hantavirus, Seoul virus, could inhibit ERK1/2 activity. Hantaviruses consist of membrane-spanning glycoproteins Gn and Gc, RNA-dependent RNA polymerase (L protein) and nucleocapsid protein N, which encapsidates the viral genome, and thus forms the ribonucleoprotein (RNP). Interaction between the cytoplasmic tails of viral glycoproteins and RNP is assumed to be the only means how viral genetic material is incorporated into infectious virions. In the second paper of this thesis, it was shown by immunoprecipitation that viral glycoproteins and RNP interact in the purified virions. It was further shown that peptides derived from the cytoplasmic tails (CTs) of both Gn and Gc could bind RNP and recombinant N protein. In the fourth paper the cytoplamic tail of Gn but not Gc was shown to interact with genomic RNA. This interaction was probably rather unspecific since binding of Gn-CT with unrelated RNA and even single-stranded DNA were also observed. However, since the RNP consists of both N protein and N protein-encapsidated genomic RNA, it is possible that the viral genome plays a role in packaging of RNPs into virions. On the other hand, the nucleic acid-binding activity of Gn may have importance in the synthesis of viral RNA. Binding sites of Gn-CT with N protein or nucleic acids were also determined by peptide arrays, and they were largely found to overlap. The Gn-CT of hantaviruses contain a conserved zinc finger (ZF) domain with an unknown function. Some viruses need ZFs in entry or post-entry steps of the viral life cycle. Cysteine residues are required for the folding of ZFs by coordinating zinc-ions, and alkylation of these residues can affect virus infectivity. In the third paper, it was shown that purified hantavirions could be inactivated by treatment with cysteine-alkylating reagents, especially N-ethyl maleimide. However, the effect could not be pin-pointed to the ZF of Gn-CT since also other viral proteins reacted with maleimides, and it was, therefore, impossible to exclude the possibility that other cysteines besides those that were essential in the formation of ZF are required for hantavirus infectivity.

Hantavirukset (perhe Bunyaviridae, suku Hantavirus) ovat vaipallisia negatiivi-juosteisen RNA genomin omaavia viruksia. Niiden kantajina on yleisesti pidetty jyrsijöitä, tosin viime aikoina on todettu joidenkin hyönteissyöjien myös voivan toimia kantajina hantaviruksille. Kantajissaan hantavirukset aiheuttavat pysyvän, oireettoman infektion. Sen sijaan ihmisissä osa hantavirus-lajeista tiedetään aiheuttavan munuaisoireista verenvuotokuumetta (HFRS), johon myös Suomessa esiintyvä Puumala-hantaviruksen aiheuttama myyräkuume (Nephropathia Epidemica) kuuluu. Munuaisoireiseen verenvuotokuumeeseen liittyy munuaisten vajaatoimintaa, mitä voidaan ainakin osittain selittää munuaisten tubulaarisolujen rappeutumisella. Jotkut hantavirukset kykenevät tietyissä olosuhteissa aiheuttamaan ohjattua solukuolemaa, apoptoosia, soluviljelymallissa ja on siksi mahdollista, että virus aikaansaa munuaisoireet suoran tubulaarisoluinfektion seurauksena. Tämän tutkimuksen ensimmäisessä osatyössä pyrittiin selvittämään solun signaalireittejä, jotka liittyvät hantavirusten aiheuttamaan apoptoosiin soluviljelymallissa. Solun elintoimintoja ylläpitävien kinaasien ERK1/2 aktiivisuuden havaittiin laskevan virus-infektion seurauksena, millä todennäköisesti on yhteys myös apoptoosin ilmentymiseen. ERK1/2 kinaasien esto oli merkittävin Tula-hantaviruksella, jonka uskotaan aiheuttavan oireettoman infektion ihmisessä, mutta se todennettiin myös taudinaiheuttamiskykyisillä hantaviruksilla. Hantavirukset koostuvat ulkokuoren vaippaproteiineista Gn ja Gc sekä vaipan sisälle pakkautuvista ribonukleoproteiineista (RNP). RNP:t koostuvat nukleokapsidiproteiinista N ja genomisesta RNA:sta. Jotta RNP:t voisivat pakkautua virukseen tehokkaasti, on niiden tunnistettava toinen tai molemmat viruksen vaippaproteiineista. Tämän tutkimuksen toisessa osatyössä RNP:n ja rekombinantti-tekniikalla tuotetun N proteiinin vuorovaikutus vaippaproteiinien Gn ja Gc välillä osoitettiin. Neljännessä osatyössä näytettiin että Gn kykenee sitomaan myös nukleiinihappoja, mukaan lukien viruksen genomista RNA:ta. Molemmissa aikasemmin mainituissa osatöissä käytettiin hyväksi myös peptideitä, joiden avulla vuorovaikutukset paikannettiin tiettyyn osaan Gn vaippaproteiinia. Nämä osatyöt yhdessä osoittavat, että RNP kykenee tunnistamaan viruksen vaippaproteiinit proteiini- ja nukleiinihappo-välitteisesti ja osaltaan selventävät hantavirusten koostumisen mekanismeja isäntäsolussa. Kolmannen osatyön tarkoituksena oli tutkia hantaviruspartikkelissa olevien vapaiden tiolien roolia viruksen sisäänmenossa isäntäsoluun. Tulokset osoittivat että vapaat tiolit ovat ratkaisevassa osassa tässä prosessissa ja että hantavirusten infektiivisyys kyetään estämään tioleja alkyloivilla yhdisteillä. Hantavirusten käsittely tiolien kanssa reagoivilla yhdisteillä ei heikentänyt virusten antigeenisuutta osoittaen, että tällä tavoin inaktivoitu hantavirus voi olla hyödyllinen diagnostiikassa tai ehkä jopa rokotteena.