Glycoprotein Interactions in the Assembly of Hantaviruses

Hantaviruses are one of the five genera of the vector-borne virus family Bunyaviridae. While other members of the family are transmitted via arthropods, hantaviruses are carried and transmitted by rodents and insectivores. Occasional transmission to humans occurs via inhalation of aerosolized rodent excreta. When transmitted to man hantaviruses cause hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS, in Eurasia, mortality ~10%) and hantavirus cardiopulmonary syndrome (HCPS, in the Americas, mortality ~40%). The single-stranded, negative-sense RNA genome of hantaviruses is in segments S, M and L that respectively encode for nucleocapsid (N), glycoproteins Gn and Gc, and RNA-dependent RNA-polymerase (RdRp or L protein). The genome segments, encapsidated by N protein to form ribonucleoprotein (RNP), are enclosed inside a lipid envelope decorated by spikes formed of Gn and Gc. The focus of this study was to understand the mechanisms and interactions through which the virion is formed and maintained. We observed that when extracted from virions both Gn and Gc favor homo- over hetero-oligomerization. The minimal glycoprotein complexes extracted from virion by detergent were observed, by using ultracentrifugation and gel filtration, to be tetrameric Gn and homodimeric Gc. These results led us to suggest a model where tetrameric Gn complexes are interconnected through homodimeric Gc units to form the grid-like surface architecture described for hantaviruses. This model was found to correlate with the three-dimensional (3D) reconstruction of virion surface created using cryo-electron tomography (cryo-ET). The 3D-density map showed the spike complex formed of Gn and Gc to be 10 nm high and to display a four-fold symmetry with dimensions of 15 nm times 15 nm. This unique square-shaped complex on a roughly round virion creates a hitch for the assembly, since a sphere cannot be broken into rectangles. Thus additional interactions are likely required for the virion assembly. In cryo-ET we observed that the RNP makes occasional contacts to the viral membrane, suggesting an interaction between the spike and RNP. We were able to demonstrate this interaction using various techniques, and showed that both Gn and Gc contribute to the interaction. This led us to suggest that in addition to the interactions between Gn and Gc, also the interaction between spike and RNP is required for assembly. We found galectin-3 binding protein (referred to as 90K) to co-purify with the virions and showed an interaction between 90K and the virion. Analysis of plasma samples taken from patients hospitalized for Puumala virus infection showed increased concentrations of 90K in the acute phase and the increased 90K level was found to correlate with several parameters that reflect the severity of acute HFRS. The results of these studies confirmed, but also challenged some of the dogmas on the structure and assembly of hantaviruses. We confirmed that Gn and RNP do interact, as long assumed. On the other hand we demonstrated that the glycoproteins Gn and Gc exist as homo-oligomers or appear in large hetero-oligomeric complexes, rather than form primarily heterodimers as was previously assumed. This work provided new insight into the structure and assembly of hantaviruses.

Hantavirukset kuuluvat vektorivälitteisten virusten muodostamaan Bunyaviridae-perheeseen ja ovat yksi perheen viidestä suvusta. Muista perheeseen kuuluvista viruksista poiketen hantavirukset ovat jyrsijä- tai hyönteissyöjävälitteisiä. Ihmiseen hantavirus siirtyy hengitysilman kautta aerosolisoituneiden jyrsijöiden eritteiden mukana ja voi aiheuttaa joko munuaisoireisen verenvuotokuumeen tai sydän-keuhko-oireyhtymän. Hantaviruksen yksijuosteinen ja negatiivisäikeinen RNA-genomi on jakautunut kolmeen osaan. Genomin osat S, M ja L koodaavat neljää rakenteellista proteiinia: nukleokapsidiproteiini (N-proteiini), glykoproteiinit Gn ja Gc sekä viruksen polymeraasientsyymi. Viruksen genomin osat pakkautuvat N-proteiinin kanssa ribonukleoproteiiniksi (RNP), joka edelleen pakkautuu glykoproteiinien peittämän lipidivaipan sisään. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli oppia ymmärtämään viruspartikkelin muodostumiseen ja koossapitämiseen tarvittavia rakenneproteiinien välisiä vuorovaikutuksia. Huomasimme, että viruspartikkelista eristettäessä glykoproteiinit muodostavat pääasiassa homo-oligomeerisia yhdistelmiä. Määritimme viruksesta eristettyjen proteiiniyhdistelmien minimaalisiksi yksiköiksi yhdistelmän, jossa on neljä Gn-proteiinia ja yhdistelmän, jossa on kaksi Gc-proteiinia. Tämän perusteella loimme hypoteesin, jonka mukaan viruksen pinta muodostuu neljän Gn-proteiinin yhdistelmistä, jotka yhdistyvät toisiinsa kahden Gc-proteiinin kautta. Kryo-elektronitomografian avulla selvitetty viruksen pintarakenne vastasi luomaamme hypoteesia ja tämän rakennetutkimuksen mukaan glykoproteiinien muodostama piikki on 10 nm korkea ja nelisymmetrinen (15 nm x 15 nm). Havaitsemamme ainutlaatuinen nelisymmetrisyys luo ongelman viruksen pakkautumiselle, sillä pallon pintaa ei voi rikkoa neliöiksi. Tästä johtuen pakkautumiseen tarvittaneen Gn- ja Gc-proteiinien välisten vuorovaikutusten lisäksi myös muita vuorovaikutuksia. Rakennetutkimuksessa selvisi, että RNP on satunnaisesti kiinnittynyt glykoproteiinien muodostamiin piikkeihin. Osoitimme biokemiallisin tekniikoin tämän vuorovaikutuksen ja samalla kävi ilmi, että molemmat glykoproteiinit osallistuvat RNP:n ja piikin väliseen sitoutumiseen. Tuloksiemme perusteella virusten pakkautumiseen tarvitaan glykoproteiinien välisten vuorovaikutusten lisäksi piikin ja RNP:n välinen vuorovaikutus. Huomasimme, että viruksien mukana puhdistuksessa kulkeutuu tuntematon komponentti ja tunnistimme sen galectin-3:a sitovaksi proteiiniksi (90K), jonka osoitimme sitoutuvan viruspartikkeliin. Analysoimme Puumala-virusinfektion takia sairaalahoitoon joutuneiden myyräkuumepotilaiden plasmanäytteistä 90K-pitoisuuden ja huomasimme sen olevan koholla taudin akuutissa vaiheessa. Lisäksi havaitsimme kohonneen 90K-pitoisuuden korreloivan taudin vakavuutta kuvaavien kliinisten parametrien kanssa. Tämän väitöskirjatutkimuksen tulokset haastoivat, mutta toisaalta myös osoittivat toteen joitakin hantavirusten rakenteeseen ja pakkautumiseen liittyviä dogmia. Osoitimme, että Gn-proteiinin ja RNP:n välillä on vuorovaikutus, kuten aiemmin oli oletettu. Toisaalta osoitimme, että glykoproteiinit muodostavat mieluummin Gn-Gn ja Gc-Gc yhdistelmiä kuin Gn-Gc yhdistelmiä. Väitöskirjatyön lopputuloksena ymmärrämme nyt paremmin hantavirusten rakennetta ja pakkautumista.