The Transcriptional Regulation of Retrotransposon BARE

The purpose of this research project was to understand the steps of the retrotransposon BARE (BArley REtrotransposon) life cycle, from regulation of transcription to Virus-Like Particle (VLP) formation and ultimate integration back into the genome. Our study concentrates mainly on BARE1 transcriptional regulation because transcription is the crucial first step in the retrotransposon life cycle. The BARE element is a Class I LTR (Long Terminal Repeat) retrotransposon belonging to the Copia superfamily and was originally isolated in our research group. The LTR retrotransposons are transcribed from promoters in the LTRs and encode proteins for packaging of their transcripts, the reverse transcription of the transcripts into cDNA, and integration of the cDNA back into the genome. BARE1 is translated as a single polyprotein and cleaved into the capsid protein (GAG), integrase (IN), and reverse transcriptase-RNaseH (RT-RH) by the integral aspartic proteinase (AP). The BARE retrotransposon family comprises more than 104 copies in the barley (Hordeum vulgare) genome. The element is bound by long terminal repeats (LTRs, 1829 bp) containing promoters required for replication, signals for RNA processing, and motifs necessary for the integration of the cDNA. Members of the BARE1 subfamily are transcribed, translated, and form virus-like particles. Several basic questions concerning transcription are explored in the thesis: BARE1 transcription control, promoter choice in different barley tissues, start and termination sites for BARE transcripts, and BARE1 transcript polyadenylation (I). Polyadenylation is an important step during mRNA maturation, and determines its stability and translatability among other characteristics. Our work has found a novel way used by BARE1 to make extra GAG protein, which is critical for VLP formation. The discovery that BARE1 uses one RNA population for protein synthesis and another RNA population for making cDNA has established the most important step of the BARE1 life cycle (III). The relationship between BARE1 and BARE2 has been investigated. Besides BARE, we have examined the retrotransposon Cassandra (II), which uses a very different transcriptional mechanism and a fully parasitic life cycle. In general, this work is focused on BARE1 promoter activity, transcriptional regulation including differential promoter usage and RNA pools, extra GAG protein production and VLP formation. The results of this study give new insights into transcription regulation of LTR retrotransposons.

Kasvien perimä koostuu pääasiassa DNA-toistoista, joita on kahdenlaisia: peräkkäisiä ja hajaantuneita. Retrotransposonit muodostavat pääosan viimeksi mainituista. Eräillä kasveilla yli 70 % perimästä koostuu retrotransposoneista, joiden DNA kuten retrovirustenkin, sisältää kaikki tiedot elinkierrossa tarvittavien proteiinien tuottamiseen. Retroviruksista poiketen ne tuottavat viruksenkaltaisia partikkeleita, koska niiltä puuttuu virusten vaippageeni. Ne kopioivat itseään kuten retrovirukset tuottaen tytärkopioita, jotka voivat liittyä takaisin kasvin perimään. Retrotransposonit ovatkin päätekijöitä kasvien perimän koon laajentumisessa ja evoluutiossa. Retrotransposoneja voidaan myös käyttää geenimerkkeinä ja apuna geneettisen monimuotoisuuden tutkimisessa kasveilla. BARE1 on ensimmäinen ohrasta löydetty kasviretrotransposoni. Se on perimän pääkomponentti ja sen toiminnalliset osat ovat hyvin säilyneet. Tämä väitöskirja keskittyy BARE1 transkription säätelyyn, koska transkriptio on ratkaiseva ja tärkein askel BARE1 elinkierrossa sekä BARE1:n lisääntymisen mekanismeihin ja viruksen kaltaisen partikkelin muodostumiseen. Tämä opinnäytetyö on vastannut useisiin kysymyksiin: BARE1 transkription säätelyyn ja promoottorin valintaan ohran solukoissa sekä lähetti-RNA:n alku- ja loppukohdan ja polyadenylaation määritys. Olemme löytäneet uudenlaisen tavan, jota BARE1 käyttää rakenneproteiinien tuottamiseksi ylimäärin ja huomasimme, että yhtä BARE1:n RNA-populaatiota käytetään proteiinisynteesiin ja toista cDNA-synteesiin. Tämä on ensimmäinen julkaisu vastaavasta mekanismista kasveilla. BARE2 :n (toinen retrotransposoni, jolla on yhteisiä konservoituneita osia BARE1:n kanssa) lähetti-RNA:t, joita pakataan BARE1-viruksen kaltaiseen partikkeliin, on tunnistettu. Olemme myös tutkineet Cassandra -retrotransposonia, jolla on hyvin erilainen transkriptiomekanismi ja täysin loisiva elintapa. Tämä opinnäytetyö ja sen tulokset luovat uusia näkökulmia LTR-retrotransposonien transkription sääntelyn avainkohtiin. Tämä edistää retrotransposoneihin pohjautuvien vektorien kehittämistä tarjoten uusia mahdollisuuksia kasvien