Immunochemical analysis of prolamins in gluten-free foods

People with coeliac disease have to maintain a gluten-free diet, which means excluding wheat, barley and rye prolamin proteins from their diet. Immunochemical methods are used to analyse the harmful proteins and to control the purity of gluten-free foods. In this thesis, the behaviour of prolamins in immunological gluten assays and with different prolamin-specific antibodies was examined. The immunoassays were also used to detect residual rye prolamins in sourdough systems after enzymatic hydrolysis and wheat prolamins after deamidation. The aim was to characterize the ability of the gluten analysis assays to quantify different prolamins in varying matrices in order to improve the accuracy of the assays. Prolamin groups of cereals consist of a complex mixture of proteins that vary in their size and amino acid sequences. Two common characteristics distinguish prolamins from other cereal proteins. Firstly, they are soluble in aqueous alcohols, and secondly, most of the prolamins are mainly formed from repetitive amino acid sequences containing high amounts of proline and glutamine. The diversity among prolamin proteins sets high requirements for their quantification. In the present study, prolamin contents were evaluated using enzyme-linked immunosorbent assays based on ω- and R5 antibodies. In addition, assays based on A1 and G12 antibodies were used to examine the effect of deamidation on prolamin proteins. The prolamin compositions and the cross-reactivity of antibodies with prolamin groups were evaluated with electrophoretic separation and Western blotting. The results of this thesis research demonstrate that the currently used gluten analysis methods are not able to accurately quantify barley prolamins, especially when hydrolysed or mixed in oats. However, more precise results can be obtained when the standard more closely matches the sample proteins, as demonstrated with barley prolamin standards. The study also revealed that all of the harmful prolamins, i.e. wheat, barley and rye prolamins, are most efficiently extracted with 40% 1-propanol containing 1% dithiothreitol at 50 °C. The extractability of barley and rye prolamins was considerably higher with 40% 1-propanol than with 60% ethanol, which is typically used for prolamin extraction. The prolamin levels of rye were lowered by 99.5% from the original levels when an enzyme-active rye-malt sourdough system was used for prolamin degradation. Such extensive degradation of rye prolamins suggest the use of sourdough as a part of gluten-free baking. Deamidation increases the diversity of prolamins and improves their solubility and ability to form structures such as emulsions and foams. Deamidation changes the protein structure, which has consequences for antibody recognition in gluten analysis. According to the resuts of the present work, the analysis methods were not able to quantify wheat gluten after deamidation except at very high concentrations. Consequently, deamidated gluten peptides can exist in food products and remain undetected, and thus cause a risk for people with gluten intolerance. The results of this thesis demonstrate that current gluten analysis methods cannot accurately quantify prolamins in all food matrices. New information on the prolamins of rye and barley in addition to wheat prolamins is also provided in this thesis, which is essential for improving gluten analysis methods so that they can more accurately quantify prolamins from harmful cereals.

Keliaakikoille on tärkeää, että gluteenittomat tuotteet ovat turvallisia eivätkä sisällä keliakiaoireita aiheuttavia vehnän, ohran ja rukiin prolamiineja. Siksi on oleellista, että prolamiinien pitoisuudet pystytään luotettavasti määrittämään. Tutkimus kohdistui gluteenin määritysmenetelmien ongelmiin ja kehittämiseen. Nykyisillä gluteenin määritysmenetelmillä saadaan joissakin tapauksissa todellisuutta suurempia gluteenipitoisuuksia, minkä seurauksena gluteenittomien tuotteiden valikoima suppenee aiheettomasti. Tutkimuksen tulokset osoittivat myös, että deamidoidun gluteenin pitoisuutta ei voida nykyisillä gluteenin määritykseen käytetyillä menetelmillä määrittää ja se voi jäädä elintarvikkeesta tunnistamatta. Vehnän prolamiinien roolia keliakiassa on tutkittu paljon ja gluteenin määritysmenetelmät ovat pääsääntöisesti kehitetty mittaamaan vehnän prolamiineja olettaen ohran ja rukiin prolamiinien vastaavan niitä ominaisuuksiltaan. Ohran ja rukiin vaikutus gluteenipitoisuuden määrittämiseen nousee esille varsinkin kauratuotteiden yhteydessä. Kauraa viljellään yleisesti samoilla alueilla kuin vehnää, ohraa ja ruista, jonka vuoksi niiden puintiin ja varastointiin käytetään usein samoja laitteita ja tiloja. Tämän seurauksena pieniä määriä keliaakikoille haitallisia viljoja pääsee helposti sekoittumaan kauran kanssa, jonka vuoksi on hyvin tärkeää pystyä luotettavasti määrittämään myös ohran ja rukiin prolamiinipitoisuudet. Tutkimus selvitti ohran sisältämien prolamiinien määrityksen luotettavuutta mitattaessa niiden pitoisuutta oluesta tai kauran seasta. Oluen prolamiineja tutkittaessa käytettiin ns. Skerrittin menetelmää, jonka tiedettiin tunnistavan ohran prolamiinit hyvin heikosti. Tutkimuksessa kehitettiin uusi standardi menetelmän sisältämän vehnän prolamiinistandardin tilalle uuttamalla prolamiinit mallastetusta ohrasta. Ohramallasstandardin avulla oluen prolamiinipitoisuudet onnistuttiin määrittämään, jonka vuoksi samaa lähestymistapaa sovellettiin myös ohrajauhojen prolamiinien määrittämiseen kaurajauhoista. Aikaisemmin oli huomattu, että uudessa ns. Méndezin gluteenin määritysmenetelmässä (R5-ELISA) hyvinkin pienet ohramäärät kauran seassa saavat aikaan suuria mitattuja gluteenipitoisuuksia. Käytettäessä ohrasta valmistettua prolamiinistandardia vehnästä valmistetun sijaan, onnistuttiin jälleen saamaan todellisuutta vastaavia gluteenipitoisuuksia. Vehnän ja ohran prolamiinien välillä ilmenneiden huomattavien erojen vuoksi, tutkimuksessa selvitettiin tarkemmin prolamiinien eroja niiden liukoisuudessa ja niiden reaktioissa gluteenin määrityksessä käytettyjen vasta-aineiden kanssa. Erityisesti ohran ja rukiin prolamiinien todettiin uuttuvan tehokkaammin 1-propanoliin kuin etanoliin, jota on yleisesti käytetty prolamiinien erottamiseen gluteenin määritystä varten. 1-propanoli sopi hyvin myös vehnälle. Tutkimuksessa osoitettiin myös selviä eroja eri gluteenin määrityksessä käytettyjen vasta-aineiden kyvyssä tunnistaa prolamiinien alaryhmiä eri viljoista. Erot vasta-aineiden välillä kuten myös erot eri prolamiinialaryhmien tunnistuksen välillä aiheuttavat suurta vaihtelua pitoisuusmäärityksiin. Lisäksi tutkimuksessa tarkasteltiin R5-vasta-aineen avulla rukiin sisältämien prolamiinien pilkkoutumista hapantaikinaprosessia mallintavissa olosuhteissa ajatuksena kehittää vähägluteeninen ruisraski. Erityisesti idätettyjen rukiiden sisältämien prolamiinien todettiin pilkkoutuvan erittäin tehokkaasti prosessin aikana. Tehokkaasta pilkkoutumisesta huolimatta ruisraskien prolamiinipitoisuudet jäivät yli vähägluteenisille tuotteille sallitun rajan 100 mg/kg, mutta sekoitettaessa raskia sopivassa määrin gluteenittomien raaka-aineiden kanssa on mahdollista valmistaa gluteeniton tuote, jossa hieman rukiin makua ja väriä. Huomionarvoisen ongelman gluteenin määritykseen aiheuttaa myös proteiinien muokkaus. Gluteenia erotetaan mittavia määriä tärkkelysteollisuuden sivutuotteena, joten sen käyttö erilaisissa elintarvikkeissa on houkuttelevaa. Tutkimuksessa testattiin deamidoimisen vaikutusta gluteenin määritykseen. Deamidointia käytetään gluteenin liukoisuuden parantamiseksi. Tulokset osoittivat selkeästi, ettei deamidoitua gluteenia pystytä luotettavasti mittaamaan. Tämän seurauksena tuotteen sisältämät huomattavatkin gluteenipitoisuudet voivat jäädä havaitsematta. Allergeenina sen tulee kuitenkin olla merkittynä ainesosalistaan. Tutkimus antaa uutta tietoa keliaakikoille haitallisten prolamiinien liukoisuudesta sekä niiden määrityksessä käytettyjen vasta-aineiden kyvystä tunnistaa erilaisia prolamiinialaryhmiä sekä proteiineja, joiden rakennetta on muutettu. Tutkimuksessa saatuja tuloksia voidaan hyödyntää gluteenin määritysmenetelmiä kehitettäessä.