Lower Gastrointestinal Microbiota in Health and Irritable Bowel Syndrome : Characterisation and Effect of Probiotic Intervention

The human gastrointestinal (GI) microbiota is a complex ecosystem that lives in symbiosis with its host. The growing awareness of the importance of the microbiota to the host as well as the development of culture-free laboratory techniques and computational methods has enormously expanded our knowledge of this microbial community. Irritable bowel syndrome (IBS) is a common functional bowel disorder affecting up to a fifth of the Western population. To date, IBS diagnosis has been based on GI symptoms and the exclusion of organic diseases. The GI microbiota has been found to be altered in this syndrome and probiotics can alleviate the symptoms, although clear links between the symptoms and the microbiota have not been demonstrated. The aim of the present work was to characterise IBS related alterations in the intestinal microbiota, their relation to IBS symptoms and their responsiveness to probiotic theraphy. In this thesis research, the healthy human microbiota was characterised by cloning and sequencing 16S rRNA genes from a faecal microbial community DNA pool that was first profiled and fractionated according to its guanine and cytosine content (%G+C). The most noticeable finding was that the high G+C Gram-positive bacteria (the phylum Actinobacteria) were more abundant compared to a corresponding library constructed from the unfractionated DNA pool sample. Previous molecular analyses of the gut microbiota have also shown comparatively low amounts of high G+C bacteria. Furthermore, the %G+C profiling approach was applied to a sample constructed of faecal DNA from diarrhea-predominant IBS (IBS-D) subjects. The phylogenetic microbial community comparison performed for healthy and IBS-D sequence libraries revealed that the IBS-D sample was rich in representatives of the phyla Firmicutes and Proteobacteria whereas Actinobacteria and Bacteroidetes were abundant in the healthy subjects. The family Lachnospiraceae within the Firmicutes was especially prevalent in the IBS-D sample. Moreover, associations of the GI microbiota with intestinal symptoms and the quality of life (QOL) were investigated, as well as the effect of probiotics on these factors. The microbial targets that were analysed with the quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) in this study were phylotypes (species definition according to 16S rRNA gene sequence similarity) previously associated with either health or IBS. With a set of samples, the presence or abundance of a phylotype that had 94% 16S rRNA gene sequence similarity to Ruminococcus torques (R. torques 94%) was shown to be associated with the severity of IBS symptoms. The qPCR analyses for selected phylotypes were also applied to samples from a six-month probiotic intervention with a mixture of Lactobacillus rhamnosus GG, L. rhamnosus Lc705, Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS and Bifidobacterium breve Bb99. The intervention had been previously reported to alleviate IBS symptoms, but no associations with the analysed microbiota representatives were shown. However, with the phylotype-specific assays applied here, the abundance of the R. torques 94% -phylotype was shown to be lowered in the probiotic-receiving group during the probiotic supplementation, whereas a Clostridium thermosuccinogenes 85% phylotype, previously associated with a healthy microbiota, was found to be increased compared to the placebo group. To conclude, with the combination of methods applied, higher abundance of Actinobacteria was detected in the healthy gut than found in previous studies, and significant phylum-level microbiota alterations could be shown in IBS-D. Thus, the results of this study provide a detailed overview of the human GI microbiota in healthy subjects and in subjects with IBS. Furthermore, the IBS symptoms were linked to a particular clostridial phylotype, and probiotic supplementation was demonstrated to alter the GI microbiota towards a healthier state with regard to this and an additional bacterial phylotype. For the first time, distinct phylotype-level alterations in the microbiota were linked to IBS symptoms and shown to respond to probiotic therapy.

Ihmisen suolistossa elää monimuotoinen ja terveydelle tärkeä mikrobisto, jonka kaikkien bakteerilajien viljelyyn ei ole olemassa menetelmää. Ärtyvä suoli -oireyhtymästä (eng. irritable bowel syndrome, IBS) kärsii jopa viidennes länsimaisista ihmisistä ja sen diagnostiikka perustuu potilaan oireisiin. Tutkimustulokset puoltavat suoliston mikrobiston olevan muuttunut IBS oireisilla terveisiin verrattuna. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli luonnehtia terveiden ja IBS-oireisten suoliston mikrobistojen koostumus viljelyvapailla menetelmillä. Tavoitteena oli myös tutkia mikrobistomuutosten yhteyttä IBS:n oireisiin ja seurata terveysvaikutteisia bakteereita (probiootteja) sisältävän valmisteen vaikutuksia mikrobistoon. Tutkimuksessa kartoitettiin terveen ihmisen suoliston mikrobisto käyttämällä menetelmää, jossa ulosteen bakteerien DNA ensin fraktioitiin sen guaniini+sytosiini -pitoisuuden (%G+C) perusteella. Fraktioista valmistettiin tämän jälkeen 16S rRNA (pienen alayksikön ribosomaalinen deoksiribonukleiinihappo) geeni kloonikirjasto, jonka klooneista edelleen sekvensoitiin (l. määritettiin DNA:n emäsjärjestys) tämä fylogeneettinen eli evoluutiopuuhun perustuva merkkigeeni. Käytetty menetelmä edesauttoi korkean %G+C pitoisuuden omaavien grampositiivisten bakteerien eli nk. Aktinobacteria-pääjakson edustajien esilletulon. Mikrobiyhteisöanalyysi vastaavalla tavalla tehdyn ripulioireisten IBS henkilöiden (IBS-D) sekvenssikirjaston kanssa osoitti, että IBS-D näytteessä oli enemmän Firmicutes ja Proteobacteria -pääjaksojen edustajia ja vähemmän Actinobacteria ja Bacteroidetes -pääjaksojen edustajia terveisiin verrattuna. Tutkimuksen kohteena olivat myös suoliston mikrobiston fylotyypit eli 16S rRNA geenin DNA:n emäsjärjestyksen perusteella määritellyt bakteerilajit, joiden määriä näytteissä mitattiin käyttämällä reaaliaikaista kvantitatiivista polymeraasiketjureaktiota. Valittuihin fylotyyppeihin kohdennetut analyysit sekä mahasuolikanavan oireita koskeva kysely yhdistivät Ruminococcus torques 94% -fylotyypin (prosentti viittaa sekvenssin samankaltaisuuteen lähimpään tunnettuun bakteerilajiin) IBS:n oireisiin. Kyseistä menetelmää käytettiin myös kuuden kuukauden probiootti-interventioon osallistuneiden näytteisiin. Tuotteen, joka sisälsi Lactobacillus rhamnosus GG, L. rhamnosus Lc705, Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS and Bifidobacterium breve Bb99 bakteereja, oli aikaisemmassa tutkimuksessa todettu lievittävän IBS:n oireita. Tätä probioottiseosta nauttineiden ryhmässä R. torques 94% -fylotyypin määrä laski kun puolestaan terveiden mikrobistoon yhdistetyn Clostridium thermosuccinogenes 85% -fylotyypin määrä nousi verrattuna lumevalmistetta nauttineisiin. Yhteenvetona voidaan sanoa, että suoliston mikrobiston kartoitus käytetyillä menetelmillä nosti havaittujen Actinobacteria pääjakson edustajien määrää. Tutkimuksessa osoitettiin myös IBS-D oireisten mikrobiston olevan muuttunut bakteeripääjaksojen osalta terveisiin nähden. Lisäksi IBS:n oireet pystyttiin yhdistämään suoliston mikrobistoon ja oireita lievittävän probioottiseoksen nauttimisen osoitettiin muuttavan mikrobistoa terveiden suuntaan. Tuloksia voidaan hyödyntää mm. IBS:n liittyvien suolistomikrobistomuutosten tutkimuksen kohdentamisessa sekä probioottien vaikutusmekanismien tutkimuksessa.