Molekyylibiologisten menetelmien kehittäminen ihmisen suoliston sulfaattia pelkistävien bakteerien määrittämiseksi

Ihmisen ruuansulatuskanavan bakteeriston kehitys alkaa syntymästä, jolloin ensimmäiset bakteerit kansoittavat steriilin ruuansulatuskanavan. Bakteeristo kehittyy perimän, ympäristön ja varhaisen ruokavalion vaikutuksesta kohti monimuotoisempaa bakteeripopulaatiota. Aikuisen ruuansulatuskanavan normaalibakteeristo on varsin muuttumaton, mutta siihen vaikuttavat monet tekijät, kuten ikä, terveydentila, ruokavalio ja antibioottien käyttö. Bakteeriston koostumus vaihtelee ruuansulatuskanavan eri osissa ja bakteerimäärä kasvaa kohti paksusuolta, ollen paksusuolessa ja ulosteessa peräti 1010-1012 pmy/ml. Suurin osa ruuansulatuskanavan bakteereista on anaerobeja. Ruuansulatuskanavan bakteeristo vaikuttaa muun muassa suoliston kehittymiseen ja hiilihydraattien ja proteiinien hajotukseen sekä toimii osana immuunipuolustusta. Sulfaattia pelkistävät bakteerit (SRB) ovat monimuotoinen ryhmä pääosin anaerobisia bakteereita, jotka käyttävät aineenvaihdunnassaan elektronin vastaanottajana sulfaattia muuttaen sen lopulta sulfidiksi. SRB:t ovat sopeutuneet useisiin erilaisiin ympäristöihin. Niitä tavataan mm. vesistöjen sedimenteissä sekä ihmisen ruuansulatuskanavassa. Ihmisen ruuansulatuskanavassa on SRB:ta n. 105-108 pmy/g, ja niitä on löydetty erityisesti anaerobisista osista kuten suun ientaskuista ja paksusuolesta. SRB:t voivat olla haitaksi ruuansulatuskanavalle tuottamansa sulfidin vuoksi, joka esiintyy vesiliuoksessa vetysulfidina. Tämän on havaittu olevan toksista suoliston epiteelisoluille. Viimeaikoina on kiinnostuttu sulfaatinpelkistäjien yhteydestä suoliston sairaustiloihin, kuten tulehduksellisiin suolistosairauksiin (IBD). Pro gradu -tutkimukseni tavoitteena oli kehittää PCR-DGGE- ja qPCR-menetelmät ulosteen sulfaattia pelkistävien bakteerien määritykseen. Kohdegeeninä menetelmänkehityksessä käytettiin dsrAB-geeniä, joka koodaa dissimilatorista sulfiitinpelkistysentsyymiä. dsrAB-geeni on sulfaatinpelkistäjille ominainen konservoitunut geenialue, johon perustuvia tutkimuksia ei vielä ole paljon ihmispuolelta. qPCR-menetelmä saatiin optimoitua herkäksi ja spesifiseksi käyttäen dsrA-geenispesifisiä alukkeita, mutta PCR-DGGE-menetelmää ei saatu optimoitua käytössä olleilla alukkeilla, jotka monistivat PCR-DGGE:ssa myös negatiivikontrollikantoja. Tutkittaessa qPCR:lla IBD:tä (Crohn ja ulseratiivinen koliitti) sairastavien lasten ja terveiden kontrollihenkilöiden ulostenäytteistä eristettyä DNA:ta, merkittävää eroa SRB-määrissä ei havaittu eri ryhmien välillä. Crohnin tautia sairastavien aktiivisen vaiheen ja oireettoman vaiheen näytteiden välillä oli kuitenkin tilastollisesti merkitsevä ero (SRB-määrät; oireeton vaihe>oireellinen vaihe) (P <0,05).

The human gastrointestinal tract (GIT) contains a complex microbiota which starts to develop after birth. Various factors such as age, health, diet and medication affect the composition of the GIT microbiota. The number and types of bacteria are different in each part of the GIT, but most of the bacteria are anaerobic. In faeces the number of bacterial cells is as high as 1011-1012 cfu/ml. The normal intestinal microbiota is essential for intestinal development, protein and carbohydrate metabolisms, and protection against pathogens. Sulphate-reducing bacteria (SRB) are typically anaerobic bacteria which use sulphate as a terminal electron acceptor to produce sulphide in their metabolism. Sulphate-reducing bacteria are widespread in all ecosystems including fresh water and marine sediments but are also present in the GIT. Most of SRB species are Gram-negative and they can use more than hundred compounds as electron donors. Dissimilatory sulphite reduction (dsrAB) gene is essential in sulphate reduction. dsrAB-gene encodes the enzyme called dissimilatory sulphite reductase, which is a key enzyme in the reduction of sulphite to sulphide. Recent findings suggest that SRB may have a role in human diseases, e.g. in periodontitis and inflammatory bowel disease (IBD). Connection between these disorders and SRB may be due to the highly toxic hydrogen sulphide. The aim of this study was to develop PCR-DGGE and qPCR methods for monitoring of sulphate-reducing bacteria from human faecal microbiota. In this study we used dsrAB-gene specific primers, which were used successfully in previous environmental microbiology studies. Previously published dsrAB-specific primers were used for PCR-DGGE. However, besides positive controls, two negative controls also amplified regardless of the modifications on temperature, amplification times, primers and MgCl2 concentration. In qPCR, specific and sensitive amplification was attained by using dsrA-gene specific primers. When the samples from paediatric patients with IBD (Crohn’s disease and ulcerative colitis) and healthy children were amplified, no differences were found between different disease groups. However there was a statistically significant difference (P <0.05) between the paediatric patients with Crohn’s disease who were on remission and those patients who’s disease was active (number of SRB; active<remission).