The role of p73 in cancer – a pathway towards more effective cancer therapy

The p53-family consists of three transcription factors, p53, p73 and p63. The family members have similar but also individual functions connected to cell cycle regulation, development and tumorigenesis. p53 and p73 act mainly as tumor suppressors. During DNA damage caused by anticancer drugs or irradiation, p53 and p73 levels are upregulated in cancer cells leading to apoptosis and cell cycle arrest. p53 is mutated in almost 50 per cent of the cancers, causing the cancer cells unable to undergo cell death. Instead, p73 is rarely mutated in cancer cells and because of that could be more viable target for anticancer therapy. The network surrounding the regulation of p73 is extensive and has several potential targets for cancer therapy. One of the most studied is Itch ligase, the negative regulator of p73 levels. Gene therapy directed towards knockdown of Itch ligase is a potential approach but in need for more in vivo proof. p73 has two isoforms, transactivating TA-forms and dominant-negative ΔN-forms. The specific regulation of these isoforms could also offer a possible way for more effective cancer treatment. The literature work includes information of structures, isoforms, functions and possible therapeutic targets of p73. Also the main therapeutic approaches to date are introduced. The experimental part is based on transfection and cytotoxicity studies done e.g. in pancreatic cancer cells (Mia PaCa-2, PANC1, BxPc-3 and HPAC). The aim of the experimental work was to optimize the conditions for effective transfection with DAB16 dendrimer nanoparticles and to measure the cytotoxicity of plain dendrimers and DAB16-pDNA complexes. Also the protein levels of p73 and Itch ligase were measured by Western blotting. The work was done as a part of a bigger project, which was aiming to down regulate Itch ligase (negative regulator of p73) by siRNA/shRNA. Tranfection results were promising, showing good transfection efficacy with DAB16 N/P30 in pancreatic cancer cells (except in BxPc-3). Pancreatic cancer cells showed recovery in 3 days after they were exposed to plain dendrimer solution or to DAB16-pDNA. Measurement of protein levels by Western blotting was not optimal and the proposals for the improvement regarding e.g. the gels and the extracted protein amounts have been done.

p53-perheeseen kuuluu kolme transkriptoivaa jäsentä, p53, p73 ja p63. Perheenjäsenillä on yhtälaisia mutta myös yksilöllisiä toimintoja liittyen solujen jakautumiskiertoon, kehittymiseen ja kasvainten syntyyn. p53 ja p73 toimivat pääasiassa tuumorisuppressoreina. Syöpälääkkeen tai säteilyn aiheuttaman DNA-vaurion yhteydessä p53 ja p73 pitoisuudet nousevat ja täten ohjaavat soluja kohti apoptoosia tai solujen jakautumiskierron keskeytymistä. p53:n on havaittu esiintyvän mutatoituneena lähes 50 prosentissa syöpäkasvaimista, estäen täten syöpäsoluja kohtaamasta apoptoosin tai jakautumiskierron keskeytymisen aiheuttamaa solukuolemaa. Toisin kuin p53, p73 ei tyypillisesti esiinny mutatoituneena syöpäsoluissa ja on sen vuoksi potentiaalisempi kohde syövän hoidossa. p73:n kontrollointiin osallistuu useita tekijöitä, joten mahdollisuudet sopivan syöpähoidon kohteen löytämiseen ovat hyvät. Itch-ligaasi kontrolloi negatiivisesti p73:n pitoisuuksia ja on yksi tutkituimmista p73:ta kontrolloivista tekijöistä. p73-tasojen nostaminen rajoittamalla Itch- ligaasin toimintaa on osoittautunut mahdolliseksi geeniterapian lähestymistavaksi. Lisää in vivo-tutkimuksia tarvitaan Itch-ligaasin terapeuttisen potentiaalin varmistamiseksi. Syöpäsolujen kohtaloon (solukuolema tai elinkykyisyyden jatkuminen) on havaittu vaikuttavan p73 isoformien (aktivoiva TA-muoto ja negatiivisesti vaikuttava ΔN-muoto) tasapaino ja tasapainon kontrollointi on mahdollisesti myös yksi tulevaisuuden syöpähoidon menetelmistä. Työn kirjallisessa katsauksessa selvitetään muun muassa p73:n rakennetta, isoformeja, tehtäviä ja mahdollisia siihen liittyviä terapeuttisia kohteita ja kohteisiin kokeltuja lähestymistapoja (in vivo ja in vitro). Kokeellinen osuus perustuu lähinnä haimasyöpäsoluihin (Mia PaCa-2, PANC1, BxPc-3 ja HPAC) dendrimeeri-nanopartikkeleiden (DAB16-pDNA) avulla tehtävän transfektoinnin onnistumisen arviointiin ja olosuhteiden optimointiin. Myös pelkän dendrimeeriliuoksen ja dendrimeeri-pDNA–kompleksin solutoksisuus testattiin, jotta voitiin arvioida solujen elinkyky transfektoinnin jälkeen. Proteiinimääritykset (p73 ja Itch) tehtiin Western blotting menetelmällä. Transfektoinnin tulokset haimasyöpäsoluilla osoittautuivat onnistuneiksi (lukuunottamatta BxPc-3-solulinjaa) ja todistivat nanopartikkeleiden toimivuuden mahdollisena geeniterapian välineenä. Solut palautuvat nanopartikkeleiden aiheuttamasta solutoksisuudesta noin kolmen päivän kuluttua nanopartikkeleiden lisäämisestä. Proteiinimääritykset Western blotting-menetelmän avulla osoittautuivat luultua hankalammaksi ja tulokset eivät onnistuneet. Mahdollisia parantamisehdotuksia menetelmän toteuttamiseen on esitetty. Kokeellinen työ on osa suurempaa p73-projektia, jossa päätavoitteena on Itch-geenin poisto (knock-out) syöpäsoluissa siRNAn/shRNA:n avulla ja sen johdosta p73-pitoisuuden nousu. Näin syöpäsolut saataisiin alttiimmiksi syöpälääkkeiden aiheuttamalle solutoksisuudelle.