Diastereomeric Drug Glucuronides: Enzymatic Glucuronidation and Analysis by Capillary Electrophoresis and Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Foreign compounds, such as drugs are metabolised in the body in numerous reactions. Metabolic reactions are divided into phase I (functionalisation) and phase II (conjugation) reactions. Uridine diphosphoglucuronosyltransferase enzymes (UGTs) are important catalysts of phase II metabolic system. They catalyse the transfer of glucuronic acid to small lipophilic molecules and convert them to hydrophilic and polar glucuronides that are readily excreted from the body. Liver is the main site of drug metabolism. Many drugs are racemic mixtures of two enantiomers. Glucuronidation of a racemic compound yields a pair of diastereomeric glucuronides. Stereoisomers are interesting substrates in glucuronidation studies since some UGTs display stereoselectivity. Diastereomeric glucuronides of O-desmethyltramadol (M1) and entacapone were selected as model compounds in this work. The investigations of the thesis deal with enzymatic glucuronidation and the development of analytical methods for drug metabolites, particularly diastereomeric glucuronides. The glucuronides were analysed from complex biological matrices, such as urine or from in vitro incubation matrices. Various pretreatment techniques were needed to purify, concentrate and isolate the analytes of interest. Analyses were carried out by liquid chromatography (LC) with ultraviolet (UV) or mass spectrometric (MS) detection or with capillary electromigration techniques. Commercial glucuronide standards were not available for the studies. Enzyme-assisted synthesis with rat liver microsomes was therefore used to produce M1 glucuronides as reference compounds. The glucuronides were isolated by LC/UV and ultra performance liquid chromatography (UPLC)/MS, while tandem mass spectrometry (MS/MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy were employed in structural characterisation. The glucuronides were identified as phenolic O-glucuronides of M1. To identify the active UGT enzymes in (±)-M1 glucuronidation recombinant human UGTs and human tissue microsomes were incubated with (±)-M1. The study revealed that several UGTs can catalyse (±)-M1 glucuronidation. Glucuronidation in human liver microsomes like in rat liver microsomes is stereoselective. The results of the studies showed that UGT2B7, most probably, is the main UGT responsible for (±)-M1 glucuronidation in human liver. Large variation in stereoselectivity of UGTs toward (±)-M1 enantiomers was observed. Formation of M1 glucuronides was monitored with a fast and selective UPLC/MS method. Capillary electromigration techniques are known for their high resolution power. A method that relied on capillary electrophoresis (CE) with UV detection was developed for the separation of tramadol and its free and glucuronidated metabolites. The suitability of the method to identify tramadol metabolites in an authentic urine samples was tested. Unaltered tramadol and four of its main metabolites were detected in the electropherogram. A micellar electrokinetic chromatography (MEKC) /UV method was developed for the separation of the glucuronides of entacapone in human urine. The validated method was tested in the analysis of urine samples of patients. The glucuronides of entacapone could be quantified after oral entacapone dosing.

Lääkeaineet joutuvat elimistössä monenlaisten biokemiallisten reaktioiden kohteiksi. Elimistö pyrkii vapautumaan lääkeaineista muuttamalla niiden rakennetta niin, että lääkkeen vaikutus lakkaa ja poistuminen elimistöstä esim. virtsaan helpottuu. Näitä tapahtumia, joissa entsyymeillä on keskeinen rooli, kutsutaan lääkeainemetaboliaksi. Maksa on lääkeainemetabolian keskus. Reaktiot jaetaan yleensä I vaiheen ja II vaiheen metaboliareaktioihin. Lääkeainemetabolian tutkiminen muodostaa keskeisen osan lääkekehitystyötä. Väitöskirja käsittelee lääkeainemetaboliaa ja erityisesti glukuronidaatiota, joka on tärkeä II vaiheen metaboliareaktio. Lisäksi työssä tarkastellaan erilaisia analyysimenetelmiä, joita tarvitaan määritettäessä glukuronidimetaboliitteja in vitro inkubointinäytteistä tai jäljitettäessä niitä elimistön nesteistä. Glukuronidaatiossa rasvaliukoiset yhdisteet muutetaan vesiliukoisiksi, polaarisiksi glukuronideiksi uridiinidifosfoglukuronosyylitransferaasi (UGT) entsyymien avustuksella. Erityisen mielenkiintoisia kohteita ovat lääkeaineet, jotka ovat kahden peilikuvaisomeerin seoksia. Glukuronidaatiossa muodostuu tällöin kaksi diastereomeerista glukuronidia. Kuitenkin jotkut UGT entsyymit saattavat hyväksyä kohdemolekyylikseen vain toisen peilikuvaisomeerin. Ensimmäisessä osatutkimuksessa O-desmetyylitramadolin glukuronideja syntetisoitiin vertailuyhdisteiksi entsymaattisen glukuronidaation avulla käyttäen UGT- lähteenä rotan maksan mikrosomeja. Geenitekniikan avulla tuotettuja UGT entsyymejä käytettiin seulontatutkimuksessa, jossa selvitettiin, mitkä UGT entsyymit katalysoivat O-desmetyylitramadolin glukuronidaatiota ihmisessä. Lisäksi tarkasteltiin entsyymien stereoselektiivisyyttä, entsyymireaktioiden nopeutta ja glukuronidaatiota ihmisen maksa- ja suolistomikrosomeissa. Väitöskirjatyössä diastereomeerisia glukuronideja analysoitiin useilla tekniikoilla. Nestekromatografiaa (LC), massaspektrometriaa (MS), tandemmassaspektrometriaa (MS/MS) ja NMR spektroskopiaa käytettiin entsyymiavusteisessa synteesissä tuotettujen O-desmetyylitramadolin glukuronidien eristämisessä ja rakenneselvityksessä. Seulontatutkimuksessa muodostuneet O-desmetyylitramadolin glukuronidit määritettiin näytteistä selektiivisellä ja nopealla LC-MS-menetelmällä. Kapillaarielektromigraatiotekniikoita, jotka tunnetaan erinomaisesta erotuskyvystään, käytettiin kolmessa osatutkimuksessa. Menetelmiä kehitettiin sekä tramadolin metaboliittien että entakaponin glukuronidien määrittämiseksi ihmisen virtsasta. Entakaponiglukuronidien määritysmenetelmä perustui miselliseen sähkökineettiseen kromatografiaan (MEKC) ja ultravioletti (UV) spektrofotometriaan. Validoitua menetelmää käytettiin entakaponiglukuronidien pitoisuuksien määrittämiseen potilasvirtsanäytteistä. Rakenneselvitys varmisti syntetisoidut glukuronidit O-desmetyylitramadolin fenolisiksi O-glukuronideiksi. Tutkimus osoitti myös, että UGT2B7 on pääasiallinen, vaikkakaan ei ainoa O-desmetyylitramadolin glukuronidaatiota katalysoiva entsyymi ihmisen maksassa. Entsyymien välillä havaittiin suuria eroja stereoselektiivisyydessä. Selektiivinen LC-MS menetelmä soveltui O-desmetyylitramadolin diastereomeeristen glukuronidien määrittämiseen inkubointinäytteistä. Diastereomeeriset entakaponiglukuronidit kyettiin määrittämään MEKC menetelmällä, suun kautta tapahtuneen entakaponiannon jälkeen. Kapillaarielektromigraatiotekniikoiden käyttöä glukuronidianalytiikassa rajoittaa UV-detektion huono herkkyys.