Studies on Causes of Multiple Sclerosis : From Genes to Transcriptome

Multiple sclerosis (MS) is the most common cause of neurological disability in young adults, affecting more than two million people worldwide. It manifests as a chronic inflammation in the central nervous system (CNS) and causes demyelination and neurodegeneration. Depending on the location of the demyelinated plaques and axonal loss, a variety of symptoms can be observed including deficits in vision, coordination, balance and movement. With a typical age of onset at 20-40 years, the social and economic impacts of MS on lives of the patients and their families are considerable. Unfortunately the current treatments are relatively inefficient and the development of more effective treatments has been impeded by our limited understanding of the causes and pathogenesis of MS. Risk of MS is higher in biological relatives of MS patients than in the general population. Twin and adoption studies have shown that familial clustering of MS is explained by shared genetic factors rather than by shared familial environment. While the involvement of the human leukocyte antigen (HLA) genes was first discovered four decades ago, additional genetic risk factors have only recently been identified through genome-wide association studies (GWAS). Current evidence suggests that MS is a highly polygenic disease with perhaps hundreds of common variants with relatively modest effects contributing to susceptibility. Despite extensive research, the majority of these risk factors still remain to be identified. In this thesis the aim was to identify novel genes and pathways involved in MS. Using genome-wide microarray technology, gene expression levels in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 12 MS patients and 15 controls were profiled and more than 600 genes with altered expression in MS were identified. Three of five selected findings, DEFA1A3, LILRA4 and TNFRSF25, were successfully replicated in an independent sample. Increased expression of DEFA1A3 in MS is a particularly interesting observation, because its elevated levels have previously been reported also in several other autoimmune diseases. A systematic review of seven microarray studies was then performed leading to identification of 229 genes, in which either decreased or increased expression in MS had been reported in at least two studies. In general there was relatively little overlap across the experiments: 11 of the 229 genes had been reported in three studies and only HSPA1A in four studies. Nevertheless, these 229 genes were associated with several immunological pathways including interleukin pathways related to type 2 and type 17 helper T cells and regulatory T cells. However, whether these pathways are involved in causing MS or related to secondary processes activated after disease onset remains to be investigated. The 229 genes were also compared with loci identified in published MS GWASs. Single nucleotide polymorphisms (SNP) in 17 of the 229 loci had been reported to be associated with MS with P-value less than 0.0001 including variants in CXCR4 and SAPS2, which were the only loci where evidence for correlation between the associated variant and gene expression was found. The CXCR4 variant was further tested for association with MS in a large case-control sample and the previously reported suggestive association was replicated (P-value is 0.0004). Finally, common genetic variants in candidate genes, which had been selected on the basis of showing association with other autoimmune diseases (MYO9B) or showing differential expression in MS in our study (DEFA1A3, LILRA4 and TNFRSF25), were tested for association with MS, but no evidence of association was found. In conclusion, through a systematic review of genome-wide expression studies in MS we have identified several promising candidate genes and pathways for future studies. In addition, we have replicated a previously suggested association of a SNP variant upstream of CXCR4 with MS. Keywords: autoimmune disease, common variant, CXCR4, DEFA1A3, HSPA1A,gene expression, genetic association, GWAS, MS, multiple sclerosis, systematic review

Pesäkekovettumatauti eli multippeli skleroosi (MS) on nuorten aikuisten yleisin neurologisiin häiriöihin johtava syy. Maailmanlaajuisesti sitä sairastaa yli kaksi miljoonaa ihmistä. Tauti ilmenee keskushermoston kroonisena tulehduksena ja johtaa myeliinikatoon ja keskushermoston rappeutumiseen. Oireet riippuvat leesioiden sijainnista keskushermostossa ja saattavat kohdistua esimerkiksi näköaistiin, tasapainoon ja koordinaatio- ja liikuntakykyyn. MS-tauti puhkeaa yleensa 20-40 vuoden iässä, joten sen sosiaaliset ja ekonomiset vaikutukset potilaisiin ja näiden lähimmäisiin ovat merkittävät. Tehokkaiden hoitojen kehittämistä on vaikeuttanut se, että taudin syyt ja mekanismit tunnetaan toistaiseksi huonosti. Todennäköisyys sairastua MS-tautiin on suurempi MS-potilaiden biologisilla sukulaisilla kuin populaatiossa keskimäärin. Kaksos- ja adoptiotutkimuksissa on osoitettu, että taudin keskittyminen perheisiin selittyy jaetuilla perinnöllisillä alttiustekijöillä. Vaikka immunologisiin soluihin liittyvien HLA-varianttien yhteys MS-tautiin osoitettiin jo lähes neljä vuosikymmentä sitten, uusia geneettisiä alttiustekijöitä on onnistuttu paikantamaan vasta viime vuosina koko genomin laajuisten assosiaatiotutkimusten avulla. Nykyisten tutkimusten valossa MS-alttiuteen vaikuttavia geenivariantteja näyttäisi kuitenkin olevan jopa satoja ja suurin osa näistä on edelleen tunnistamatta. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tunnistaa uusia MS-tautiin liittyviä geenejä ja reaktioreittejä. Geenien ilmentymistasoja verrattiin ensin periferaalisissa mononukleaarisissa immuunisoluissa MS-potilaiden ja verrokkien välillä käyttäen mikrosirutekniikkaa, joka mahdollistaa kaikkien tunnettujen geenien samanaikaisen tarkastelun. Yli 600 geenin ilmentymisen havaittiin poikkeavan merkitsevästi MS-potilaiden ja verrokkien välillä. Tunnistetuista geeneistä viisi valittiin toistotutkimukseen, jossa kolmen geenin (DEFA1A3, LILRA4 ja TNFRSF25) tapauksessa ilmentymisero potilaiden ja verrokkien välillä toistui. Näistä geeneistä DEFA1A3 on erityisen kiinnostava, sillä sen ilmentymistason on havaittu olevan verrokkeja korkeampi myös muissa autoimmuunisairauksissa. Koska vastaavia mikosirututkimuksia on tehty MS-taudissa myös aiemmin, yhtenä väitöskirjan tavoitteena oli verrata tuloksia näistä tutkimuksista. Vertailuun otettiin kaikkiaan seitsemän tutkimusta, mukaan lukien tämän väitöskirjan osana tehty tutkimus. Tavoitteena oli tunnistaa geenit, joissa ilmentymisen oli raportoitu poikkeavan MS-potilaiden ja verrokkien välillä ainakin kahdessa tutkimuksessa. Vaikka tällaisia geenejä tunnistettiin 229, yleisesti ottaen tutkimustulosten välillä oli kuitenkin vähän päällekkäisyyttä: vain 11 geeniä oli raportoitu kolmessa tutkimuksessa ja ainoastaan yksi, HSPA1A, neljässä tutkimuksessa. Reaktioreittianalyysin avulla osoitettiin, että tunnistetut 229 geeniä assosioituvat merkittävästi useisiin mielenkiintoisiin immunologisiin reaktioreitteihin. Monet näistä liittyvät tiettyihin T-solutyppeihin, joiden merkitystä sekä MS-taudin alttiuden että taudin etenemisen ja patogeneesin kannalta on tulostemme perusteella syytä tutkia lisää. 229 geenistä ainoastaan 17 on aiemmin raportoitu assosioituvan MS-tautiin, mikä viittaisi siihen että nämä 229 geeniä eivät välttämättä ole merkittäviä taudin alttiuden lisäämisen kannalta, mutta voivat liittyä taudin mekanismeihin taudin puhkeamisen jälkeen. 17 geenistä ainoastaan SAPS2- ja CXCR4-geenien tapauksessa havaitsimme yhteyden geenin ilmentymisen ja geneettisen riskivariantin välillä siten, että molemmissa tapauksissa geenin ilmentyminen oli koholla riskialleelin kantajilla. Lopuksi väitöskirjassa testattiin tämän CXCR4-lokuksessa sijaitsevan variantin assosiaatiota MS-tautiin tuhansien henkilöiden potilas-kontrolli aineistossa ja aiemmissa tutkimuksissa havaittu assosiaatio toistettiin (P-arvo on 0.0004). Lisäksi tutkittiin valituissa ehdokasgeeneissä sijaitsevien yleisten geneettisten varianttien yhteyttä MS-tautiin. Edellä mikrosirututkimuksessa tunnistettujen DEFA1A3-, LILRA4- ja TNFRSF25-geenien lisäksi tarkasteltiin MYO9B-geeniä, jonka oli aiemmin havaittu assosioituvan muihin autoimmuunisairauksiin. Merkitsevää yhteyttä MS-taudin ja tarkasteltujen geneettisten varianttien välillä ei kuitenkaan havaittu. Yhteenvetona, tässä väitöskirjassa on geenien ilmentymistutkimusten ja niiden systemaattisen katsauksen avulla tunnistettu useita lupaavia ehdokasgeenejä (mm. DEFA1A3, LILRA4, TNFRSF25 ja HSPA1A) ja erityisesti T-soluihin liittyviä reaktioreittejä. Lisäksi väitöskirjassa on toistettu aiemmin raportoitu assosiaatio MS-taudin ja CXCR4-lokuksessa sijaitsevan geneettisen variantin välillä. Tunnistettujen geenien rooli MS-taudin patogeneesissä on kuitenkin toistaiseksi tuntematon, joten tarkempia jatkotutkimuksia tarvitaan. Avainsanat: CXCR4, DEFA1A3, HSPA1A, geenien ilmentyminen, geneettinen assosiaatio, GWAS, MS-tauti, multippeli skleroosi, pesäkekovettumatauti, yleinen variantti