Accurate mass-based analysis in human sport doping control : Application of liquid chromatography - time-of-flight mass spectrometry

Human sport doping control analysis is a complex and challenging task for anti-doping laboratories. The List of Prohibited Substances and Methods, updated annually by World Anti-Doping Agency (WADA), consists of hundreds of chemically and pharmacologically different low and high molecular weight compounds. This poses a considerable challenge for laboratories to analyze for them all in a limited amount of time from a limited sample aliquot. The continuous expansion of the Prohibited List obliges laboratories to keep their analytical methods updated and to research new available methodologies. In this thesis, an accurate mass-based analysis employing liquid chromatography - time-of-flight mass spectrometry (LC-TOFMS) was developed and validated to improve the power of doping control analysis. New analytical methods were developed utilizing the high mass accuracy and high information content obtained by TOFMS to generate comprehensive and generic screening procedures. The suitability of LC-TOFMS for comprehensive screening was demonstrated for the first time in the field with mass accuracies better than 1 mDa. Further attention was given to generic sample preparation, an essential part of screening analysis, to rationalize the whole work flow and minimize the need for several separate sample preparation methods. Utilizing both positive and negative ionization allowed the detection of almost 200 prohibited substances. Automatic data processing produced a Microsoft Excel based report highlighting the entries fulfilling the criteria of the reverse data base search (retention time (RT), mass accuracy, isotope match). The quantitative performance of LC-TOFMS was demonstrated with morphine, codeine and their intact glucuronide conjugates. After a straightforward sample preparation the compounds were analyzed directly without the need for hydrolysis, solvent transfer, evaporation or reconstitution. The hydrophilic interaction technique (HILIC) provided good chromatographic separation, which was critical for the morphine glucuronide isomers. A wide linear range (50-5000 ng/ml) with good precision (RSD<10%) and accuracy (±10%) was obtained, showing comparable or better performance to other methods used. In-source collision-induced dissociation (ISCID) allowed confirmation analysis with three diagnostic ions with a median mass accuracy of 1.08 mDa and repeatable ion ratios fulfilling WADA s identification criteria. The suitability of LC-TOFMS for screening of high molecular weight doping agents was demonstrated with plasma volume expanders (PVE), namely dextran and hydroxyethylstarch (HES). Specificity of the assay was improved, since interfering matrix compounds were removed by size exclusion chromatography (SEC). ISCID produced three characteristic ions with an excellent mean mass accuracy of 0.82 mDa at physiological concentration levels. In summary, by combining TOFMS with a proper sample preparation and chromatographic separation, the technique can be utilized extensively in doping control laboratories for comprehensive screening of chemically different low and high molecular weight compounds, for quantification of threshold substances and even for confirmation. LC-TOFMS rationalized the work flow in doping control laboratories by simplifying the screening scheme, expediting reporting and minimizing the analysis costs. Therefore LC-TOFMS can be exploited widely in doping control, and the need for several separate analysis techniques is reduced.

Antidopinglaboratorioiden työ on monimutkaista ja haastavaa. Dopingvalvonnan ja -analytiikan selkärankana on Maailman Antidopingtoimiston (WADA) `Kielletyt aineet ja menetelmät´ - julkaisu, jossa on listattu ja määritelty urheilussa kielletyt keinot. Listaa päivitetään vuosittain ja listalla olevien yhdisteiden määrä kasvaa koko ajan. Lista sisältää satoja kemiallisesti ja farmakologisesti erilaisia yhdisteitä, jotka laboratorion on pystyttävä analysoimaan luotettavasti rajoitetusta näytemäärästä annettujen raportointiaikojen puitteissa. Laboratorioiden onkin jatkuvasti päivitettävä ja kehitettävä analyysimenetelmiä pystyäkseen vastaamaan kasvaviin haasteisiin. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin laajamittaisesti tarkan molekyylimassan mittaamiseen perustuvan tekniikan, nestekromatografia lentoaikamassaspektrometrian, soveltuvuutta dopinganalytiikan eri tarpeisiin. Tutkimuksessa kehitetyt analyysimenetelmät perustuivat nykyaikaisen lentoaikamassaspektrometrin korkeaan massatarkkuuteen sekä laitteen tuottamaan suureen analyyttisen tiedon määrään. Mittaustekniikan soveltuvuus laaja-alaiseen dopingyhdisteiden seulontaan virtsasta osoitettiin tässä väitöskirjatyössä nyt ensimmäistä kertaa. Aikaa vievään näytteiden esikäsittelyyn kiinnitettiin erityisesti huomiota, jotta pystyttäisiin vähentämään erillisten työvaiheiden määrää ja lisäämään seulonnan kattavuutta. Kehitetyssä seulontamenetelmässä pystyttiin mittaamaan lähes 200 urheilussa kiellettyä, kemiallisesti erilaista ainetta yhdessä analyysissä WADA:n edellyttämällä herkkyystasolla. Mittaustulosten tulkinta tapahtui automaattisesti yhdisteiden tarkkaa massaa, isotooppijakaumaa ja kromatografista retentioaikaa käyttäen. Lentoaikamassaspektrometrian käyttömahdollisuudet tarkoissa pitoisuusmäärityksissä osoitettiin kehittämällä tarkka analyysimenetelmä morfiinin, kodeiinin ja niiden aineenvaihduntatuotteiden mittaamiseen virtsasta. Näytteen esikäsittely oli yksinkertainen, mikä vähensi mittauksen mahdollisia virhelähteitä ja lisäksi paransi mittauksen toistettavuutta. Morfiinin ja kodeiinin vaikeasti mitattavat glukuronidikonjugaatit erotettiin kromatografisesti niiden hydrofiilisyyteen perustuen ja mitattiin spesifisesti lentoaikamassaspektrometrian avulla korkeaan massatarkkuuteen perustuen. Kehitetty menetelmä täytti herkkyyden, toistettavuuden ja tarkkuuden suhteen WADA:n asettamat vaatimukset pitoisuusmäärityksille. Mittaustekniikan sopivuus myös suurten molekyylien seulontaan osoitettiin sokeripolymeerirakenteisten plasmavolyymilaajentajien (dekstraani, hydroksietyylitärkkelys) avulla. Sokeripolymeerit erotettiin kokonsa perusteella kromatografisesti muista virtsaan erittyvistä pienistä ja häiritsevistä yhdisteistä, mikä lisäsi menetelmän spesifisyyttä. Tunnistuksen perusteena olivat yhdisteiden molekyylikoko, tarkka massa sekä spesifiset molekyylin pilkkoutumistuotteet. Lentoaikamassaspektrometria yhdistettynä erilaisiin esikäsittelymenetelmiin ja kromatografisiin erotustekniikkoihin osoittautui hyödylliseksi työvälineeksi dopingvalvontalaboratoriossa pienten ja suurten molekyylien seulonnassa, pitoisuusmäärityksissä sekä varmistusanalyyseissä. Työssä kehitetyt analyysistrategiat tehostivat käytännön dopinganalytiikkaa yksinkertaistamalla seulontaa, nopeuttamalla raportointia sekä vähentämällä analyysikustannuksia. Tarkan molekyylimassan mittaamiseen perustuva lentoaikamassaspektrometria soveltuu hyvin dopinganalytiikkaan vähentäen erillisten analyysitekniikoiden tarvetta.