A metabolomic approach to studying mechanisms of polymeric gene delivery to retinal pigment epithelial cells

Tiivistelmä ReferatAbstract Metabolomics is a rapidly growing research field that studies the response of biological systems to environmental factors, disease states and genetic modifications. It aims at measuring the complete set of endogenous metabolites, i.e. the metabolome, in a biological sample such as plasma or cells. Because metabolites are the intermediates and end products of biochemical reactions, metabolite compositions and metabolite levels in biological samples can provide a wealth of information on on-going processes in a living system. Due to the complexity of the metabolome, metabolomic analysis poses a challenge to analytical chemistry. Adequate sample preparation is critical to accurate and reproducible analysis, and the analytical techniques must have high resolution and sensitivity to allow detection of as many metabolites as possible. Furthermore, as the information contained in the metabolome is immense, the data set collected from metabolomic studies is very large. In order to extract the relevant information from such large data sets, efficient data processing and multivariate data analysis methods are needed. In the research presented in this thesis, metabolomics was used to study mechanisms of polymeric gene delivery to retinal pigment epithelial (RPE) cells. The aim of the study was to detect differences in metabolomic fingerprints between transfected cells and non-transfected controls, and thereafter to identify metabolites responsible for the discrimination. The plasmid pCMV-β was introduced into RPE cells using the vector polyethyleneimine (PEI). The samples were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC) and ultra performance liquid chromatography (UPLC) coupled to a triple quadrupole (QqQ) mass spectrometer (MS). The software MZmine was used for raw data processing and principal component analysis (PCA) was used in statistical data analysis. The results revealed differences in metabolomic fingerprints between transfected cells and non-transfected controls. However, reliable fingerprinting data could not be obtained because of low analysis repeatability. Therefore, no attempts were made to identify metabolites responsible for discrimination between sample groups. Repeatability and accuracy of analyses can be influenced by protocol optimization. However, in this study, optimization of analytical methods was hindered by the very small number of samples available for analysis. In conclusion, this study demonstrates that obtaining reliable fingerprinting data is technically demanding, and the protocols need to be thoroughly optimized in order to approach the goals of gaining information on mechanisms of gene delivery.

Metabolomik är ett växande vetenskapsområde inom vilket man studerar hur biologiska system reagerar på olika miljöfaktorer, sjukdomstillstånd och genetiska förändringar. Metabolomik syftar till att mäta alla endogena metaboliter, d.v.s. metabolomet, i ett biologiskt system så som plasma eller celler. Eftersom metaboliter är mellanprodukter och slutprodukter av biokemiska reaktioner kan sammansättningen och koncentrationen av metaboliter i biologiska prov ge viktig information om pågående processer i levande system. Studier av metabolomet är komplexa och metabolomikanalyser är en utmaning i analytisk kemi. Korrekt provförbehandling är ytterst viktig för exakta och upprepbara analyser, och den analytiska tekniken måste ha hög upplösning och känslighet för att så många metaboliter som möjligt ska detekteras. Eftersom det finns en överväldigande mängd information i metabolomet resulterar metabolomikstudier i mycket stora datamängder. För att hantera dessa datamängder behövs effektiva databehandlingsmetoder och multivariata analysmetoder. I denna avhandling presenteras en studie där metabolomik användes för att undersöka mekanismer bakom genöverföring med en polymer-baserad vektor till retinala pigment epitelceller (RPE). Målet med denna studie var att upptäcka variation mellan transfekterade cellers och icke-transfekterade cellers metabolitprofil, och att därefter identifiera de metaboliter som är viktigast för att förklara denna variation. Plasmiden pCMV-β introducerades till RPE celler med en polyetylenimine (PEI) vektor. Proven analyserades med högupplösande vätskekromatografi (HPLC) och ultra högupplösande vätskekromatografi (UPLC) kopplat till tandem masspektroskopi (trippelkvadrupol MS). Rådata från LC-MS analyserna behandlades med mjukvaran MZmine och den transformerade datan användes sedan för statistisk dataanalys, d.v.s. principalkomponentanalys (PCA). Resultaten avslöjade skillnader i metabolitprofilerna mellan transfekterade och icke-transfekterade celler. Analysernas upprepbarhet visade sig dock vara dålig, och inga upprepbara metabolitprofiler kunde erhållas. I och med den dåliga upprepbarheten gjordes inga försök till att identifiera de metaboliter som bidrog till variation mellan transfekterade och icke-transfekterade celler. Analysers exakthet och upprepbarhet kan i allmänhet förbättras genom optimering av använda analysmetoder. I denna studie kunde dock ingen optimering utföras på grund av ett allt för litet provantal. Sammanfattningsvis kan man konstatera att det är tekniskt svårt att erhålla tillförlitliga metabolitprofiler, och noggrann optimering av analysmetoderna är viktig för att man ska kunna nå målet om att få mer information om mekanismerna bakom genöverföring.