Two levels of MCT1 and CD147 expression in the equine red blood cells and muscle

Monocarboxylate transporters (MCTs), especially the isoforms MCT1 - MCT4, cotransport lactate and protons across the cell membranes. They are thus essential for pH regulation and homeostasis in glycolytic cells such as red blood cells (RBCs), and skeletal muscle cells during intense exercise. In 70% of the Standardbred horses the lactate transport activity (TA) in RBCs is high and transport is mediated mainly by MCTs. In the rest 30% of the Standardbreds MCT mediated transport route is not active and the TA is low. MCTs need an ancillary protein for their proper localization and functioning in the plasma membrane. The ancillary protein for MCT1 and MCT4 is a member of immunoglobulin superfamily, CD147. Here we determined the expression of MCT isoforms and CD147 in equine RBCs and gluteal muscle. We sequenced the cDNA of horse MCT1 and CD147 to achieve horse-specific antibodies and to reveal sequence variations that may affect the TA of RBCs. The amount of MCT1 and CD147 mRNA in muscle were also studied. ---- In all, 73 horses representing different breeds were used. Blood samples were drawn from the jugular vein and muscle samples were taken either from gluteal muscle using biopsy needle or during castration from expendable cremaster muscle. The TA of RBCs was studied using radiolabeled lactate and the amount of MCT isoforms and CD147 in the plasma membranes using Western blotting. The level of mRNA in muscle cells was determined using qPCR. Isoforms MCT1 and MCT2 were found in the RBCs and isoforms MCT1 and MCT4 in the muscle cells of horses. The TA of RBCs was dependent on the expression of CD147 and MCT1 in the plasma membrane. Sequence variations were found in the cDNA of both MCT1 and CD147, but they did not explain the inactivity of MCT1 mediated transport route. The single nucleotide polymorphism (SNP) Met125Val in CD147 that existed parallel with an SNP in 3´-untranslated region explained, however, attenuation in CD147 expression in Standardbreds. A single mutation Ile51Val also decreased the expression of CD147 in one Warmblood. The MCT1 and CD147 mRNA concentrations in the gluteal muscle were higher in horses with higher MCT1 and CD147 expression in RBCs and lower in horses with minor expression of CD147 and MCT1. This suggests that the bimodal distribution of TA is due to differences in transcriptional regulation that is functioning in parallel in MCT1 and CD147 gene.

Monokarboksylaattikuljettaja(MCT)-proteiiniperheen alamuodot 1-4 ovat solukalvoproteiineja, jotka kuljettavat samanaikaisesti laktaattianionin ja protonin solukalvon läpi. MCT-proteiinit ovat siten välttämättömiä pH:n säätelylle ja homeostaasin säilymiselle laktaattia tuottavissa soluissa kuten punasoluissa ja rasituksen aikana lihassoluissa. Asettuakseen solukalvolle ja toimiakseen siellä oikein MCT-proteiinit tarvitsevat apuproteiinin. Proteiinin MCT1 ja MCT4 apuproteiini on CD147, jäsen laajasta immunoglobuliinien perheestä. Aiemmin on havaittu, että lämminveriravureista n. 70% kuljettaa laktaattia punasolukalvon läpi MCT-proteiinien avulla ja näillä hevosilla laktaatinkuljetus on tarvittaessa hyvin tehokasta. Lopuilla 30%:lla lämminveriravureista MCT-välitteinen kuljetusreitti ei toimi ja punasolujen laktaatinkuljetuskyky on alhainen. Tämän väitöskirjan tarkoituksena oli selvittää syitä hevosen punasolujen kaksijakoiselle laktaatinkuljetusaktiivisuudelle. Ilmiölle etsittiin myös yhtäläisyyksiä ja seuraamuksia lihastasolla. Väitöskirjassa mitattiin hevosten punasolujen laktaatinkuljetusaktiivisuutta sekä tutkittiin MCT-proteiinin eri alamuotojen ja CD147:n esiintymistä hevosen punasoluissa ja lihaksessa. MCT1:n ja CD147:n geenisekvensseistä etsittiin mahdollisia muutoksia, jotka voisivat vaikuttaa MCT-välitteisen kuljetusreitin inaktivoitumiseen. Myös MCT1:n ja CD147:n mRNA:n määrää lihassoluissa mitattiin. Työssä otettiin näytteitä yhteensä 73 hevosesta, joista 55 oli lämminveriravureita. Verinäytteet otettiin kaulalaskimosta ja lihasnäytteet joko lautaslihaksesta tai kastraation yhteydessä kiveksenkohottajalihaksesta. Hevosen punasoluista löydettiin proteiineja MCT1 ja MCT2 ja lihaksesta proteiineja MCT1 ja MCT4. Punasolujen laktaatinkuljetusaktiivisuus riippui MCT1:n ja CD147:n esiintymisestä solukalvolla. Hevosilla, joilla proteiinien määrä oli vähäinen tai proteiineja ei havaittu lainkaan, kuljetusaktiivisuus oli alhainen. Sekä MCT1:n ja CD147:n geenisekvensseistä löydettiin muutoksia, mutta ne eivät selittäneet täydellistä proteiinien puuttumista punasolujen solukalvoilta. Yleistynyt yhden nukleotidin muutos (SNP), joka aiheutti aminohappomuutoksen Met125Val lämminveriravureiden CD147-proteiinissa ja esiintyi rinnakkain toisen SNP:n kanssa, sai aikaan CD147:n määrän vähentymisen solukalvolla. Samoin yksittäisellä hevosella esiintynyt nukleotidimuutos, joka aiheutti aminohappomuutoksen Ile51Val CD147:ssä, vähensi CD147 esiintymistä sekä punasoluissa että lihaksessa ja oli mahdollisena syynä kastraatio-operaation jälkeiseen lihasarvojen nousuun. Sekä MCT1:n että CD147:n mRNA tasot lautaslihaksessa olivat korkeammat hevosilla, joiden punasolukalvolla kyseisiä proteiineja esiintyi runsaammin. Tutkimusten perusteella löytyi ainakin kolme tekijää, jotka vähentävät kuljettajaproteiinien esiintymistä puna- ja lihassolujen solukalvolla ja saattavat vaikuttaa edelleen solujen laktaatinkuljetukseen: 1. Yksittäiset mutaatiot apuproteiinin geenissä 2. SNP:t apuproteiinin geenissä 3. Tällä hetkellä tuntematon transkription säätelytekijä, joka vaikuttaa sekä MCT1-proteiinin että CD147:n esiintymiseen solukalvolla.