Optimization of sample preparation for next-generation sequencing with Illumina Genome Analyzer II

The growing interest for sequencing with higher throughput in the last decade has led to the development of new sequencing applications. This thesis concentrates on optimizing DNA library preparation for Illumina Genome Analyzer II sequencer. The library preparation steps that were optimized include fragmentation, PCR purification and quantification. DNA fragmentation was performed with focused sonication in different concentrations and durations. Two column based PCR purification method, gel matrix method and magnetic bead based method were compared. Quantitative PCR and gel electrophoresis in a chip were compared for DNA quantification. The magnetic bead purification was found to be the most efficient and flexible purification method. The fragmentation protocol was changed to produce longer fragments to be compatible with longer sequencing reads. Quantitative PCR correlates better with the cluster number and should thus be considered to be the default quantification method for sequencing. As a result of this study more data have been acquired from sequencing with lower costs and troubleshooting has become easier as qualification steps have been added to the protocol. New sequencing instruments and applications will create a demand for further optimizations in future.

Viimeisen vuosikymmenen aikana sekvensointisovellukset ovat kehittyneet tehokkaammiksi ja vastaamaan paremmin alati kasvavaa kysyntää. Tämä tutkielma keskittyy DNA näytteiden esikäsittelyn optimointiin Illuminan Genome analyzer II –sekvensointiin. Näytteiden esikäsittelyvaiheista optimoitiin fragmentaatio, PCR-reaktion jälkeinen puhdistus sekä kvantitointi. Ihmis- ja bakteeri-DNA:ta fragmentoitiin käyttämällä kohdistettua ääniaaltoa. Fragmentointi testattiin eri aikapisteiden ja näytemäärien suhteen. Puhdistusmenetelmistä verrattiin kahta eri pylväspuhdistusmenetelmää, geelipylväästä resiinillä ja ilman sekä magneettihelmiin perustuvaa puhdistusta. Kvantitatiivista PCR:ää ja geelielektroforeesia sirulla verrattiin DNA-määrän mittaamiseen. Puhdistusmenetelmistä magneettihelmipuhdistus toimi tehokkaimmin ja on parhaiten muokattavissa. Fragmentointi optimoitiin isommille fragmenteille ja se on joustavammin muokattavissa. Kvantitointimenetelmistä kvantitatiivinen PCR korreloi parhaiten syntyneiden klustereiden kanssa. Tämän tutkielman tuloksena sekvensointiajot tuottavat enemmän dataa edullisemmin. Lisäksi laadunvarmistuspisteet helpottavat vianmääritystä. Uudet sekvensointilaitteet ja –sovellukset tulevat vaatimaan optimointia myös jatkossa.

Bio- ja ympäristötieteiden laitos, HEBIOT, bioteknologia