Real-Time PCR : A Molecular Approach to Investigate the Role of Intestinal Microbiota in the Pathophysiology of Irritable Bowel Syndrome

Irritable bowel syndrome (IBS) is a common multifactorial functional intestinal disorder, the pathogenesis of which is not completely understood. Increasing scientific evidence suggests that microbes are involved in the onset and maintenance of IBS symptoms. The microbiota of the human gastrointestinal (GI) tract constitutes a massive and complex ecosystem consisting mainly of obligate anaerobic microorganisms making the use of culture-based methods demanding and prone to misinterpretation. To overcome these drawbacks, an extensive panel of species- and group-specific assays for an accurate quantification of bacteria from fecal samples with real-time PCR was developed, optimized, and validated. As a result, the target bacteria were detectable at a minimum concentration range of approximately 10 000 bacterial genomes per gram of fecal sample, which corresponds to the sensitivity to detect 0.000001% subpopulations of the total fecal microbiota. The real-time PCR panel covering both commensal and pathogenic microorganisms was assessed to compare the intestinal microbiota of patients suffering from IBS with a healthy control group devoid of GI symptoms. Both the IBS and control groups showed considerable individual variation in gut microbiota composition. Sorting of the IBS patients according to the symptom subtypes (diarrhea, constipation, and alternating predominant type) revealed that lower amounts of Lactobacillus spp. were present in the samples of diarrhea predominant IBS patients, whereas constipation predominant IBS patients carried increased amounts of Veillonella spp. In the screening of intestinal pathogens, 17% of IBS samples tested positive for Staphylococcus aureus, whereas no positive cases were discovered among healthy controls. Furthermore, the methodology was applied to monitor the effects of a multispecies probiotic supplementation on GI microbiota of IBS sufferers. In the placebo-controlled double-blind probiotic intervention trial of IBS patients, each supplemented probiotic strain was detected in fecal samples. Intestinal microbiota remained stable during the trial, except for Bifidobacterium spp., which increased in the placebo group and decreased in the probiotic group. The combination of assays developed and applied in this thesis has an overall coverage of 300-400 known bacterial species, along with the number of yet unknown phylotypes. Hence, it provides good means for studying the intestinal microbiota, irrespective of the intestinal condition and health status. In particular, it allows screening and identification of microbes putatively associated with IBS. The alterations in the gut microbiota discovered here support the hypothesis that microbes are likely to contribute to the pathophysiology of IBS. The central question is whether the microbiota changes described represent the cause for, rather than the effect of, disturbed gut physiology. Therefore, more studies are needed to determine the role and importance of individual microbial species or groups in IBS. In addition, it is essential that the microbial alterations observed in this study will be confirmed using a larger set of IBS samples of different subtypes, preferably from various geographical locations.

Ärtyvä suoli -oireyhtymä (irritable bowel syndrome, IBS) on yleisin diagnosoitu gastroenterologinen häiriötila. Oireyhtymää esiintyy länsimaissa noin 20%:lla aikuisista ihmisistä, joten sen aiheuttamat inhimilliset kärsimykset sekä sosioekonomiset kustannukset ovat huomattavia. Oireyhtymän tyypillisiä oireita ovat vatsakipu, vatsan turvotus, suolentoiminnan vaihtelu, liiallinen kaasunmuodostus paksusuolessa sekä epätavallinen suolen koostumus, joka usein esiintyy ummetuksena tai ripulina. IBS:n varsinaista aiheuttajaa ei vielä ole saatu selvitettyä. Tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että oireyhtymän laukaisevia tekijöitä saattavat olla muutokset suolistomikrobiston koostumuksessa, epänormaalit muutokset paksusuolen aineenvaihdunnassa sekä patogeenisten bakteerien aiheuttamat infektiot. Mikään näistä ei kuitenkaan ole toistaiseksi varmuudella yksin selittänyt IBS:n etiologiaa. Ihmisen suolistossa elää lukumääräisesti suuri ja koostumukseltaan monimuotoinen mikrobiyhteisö, joka on yhteydessä terveyteen ja fysiologiaan. Se suojaa suolistoa haitallisilta patogeeneilta, vuorovaikuttaa ihmisen immuunijärjestelmän ja suolen epiteelisolujen kanssa sekä tuottaa ravintoaineita ja vitamiineja. Valtaosa suolistossa elävistä mikrobeista on anaerobisia, mikä vaikeuttaa niiden tutkimista viljelyyn perustuvilla menetelmillä. Tutkimuksen lähtökohtana ja tavoitteena oli soveltaa viljelystä riippumatonta nukleiinihappopohjaista kvantitatiivista reaaliaikaista polymeraasiketjureaktio (PCR) -menetelmää IBS-potilaiden ja yleisesti ihmisen suolistomikrobiston keskeisten bakteeriryhmien kartoittamiseksi. Kvantitatiivinen PCR osoittautui erittäin herkäksi ja toistettavaksi mikrobiston tutkimusmenetelmäksi. Kohdebakteerit saatiin määritettyä aina noin 10 000 bakteerigenomiin grammassa näytettä, mikä vastaa 0.000001% osuutta kokonaismikrobistosta. Työn seuraavassa vaiheessa kehitettyä menetelmää sovellettiin IBS-potilaiden ja terveiden verrokkien suolistomikrobiston vertailuun. Sekä IBS-potilaiden että terveiden verrokkien mikrobisto vaihteli voimakkaasti yksilöiden välillä. IBS-potilaiden jaottelu oiretyyppien mukaan (ripuli, ummetus ja vaihteleva oireisto) paljasti, että ripulityypin potilailla oli vähemmän Lactobacillus-suvun edustajia, kun taas ummetustyypin potilaiden näytteissä Veillonella-suvun määrä oli suurempi. Kun näytteistä määritettiin tunnettuja taudinaiheuttajia, 17% IBS-potilaiden näytteistä osoittautui Staphylococcus aureus -positiivisiksi. Vastaavasti terveistä verrokeista Staphylococcus aureus -bakteeria ei löytynyt. Menetelmää käytettiin myös seuraamaan kolmea probioottilajia sisältävän valmisteen vaikutuksia IBS-potilaiden mikrobistoon. Plasebokontrolloidussa kaksoissokkokokeessa kaikki probioottilajit löydettiin niiden potilaiden ulostenäytteistä, joille probioottivalmistetta oli annettu. Suoliston mikrobisto pysyi kokeen ajan vakaana, lukuun ottamatta Bifidobacterium-sukua, jonka määrä lisääntyi plaseboryhmässä ja väheni probioottiryhmässä. Työssä kehitetty kvantitatiiviseen PCR -menetelmään perustuva analyysipaneeli kattaa 300-400 tunnettua bakteerilajeja ja lisäksi joukon toistaiseksi tuntemattomia mikrobeja. Näin ollen se soveltuu erinomaisesti sekä terveiden että erilaisista suoliston häiriöistä kärsivien ihmisten suolistomikrobien tutkimiseen. Erityisesti se mahdollistaa ärtyvä suoli -oireyhtymään mahdollisesti liittyvien mikrobien etsimisen ja löytämisen. Tutkimuksessa kuvatut mikrobimuutokset tukevat ajatusta, että mikrobit vaikuttavat IBS:n taudinkuvaan. Keskeistä on kuitenkin, ovatko mikrobimuutokset taudin syy vai seuraus. Tästä johtuen tarvitaan lisätutkimuksia selvittämään, mikä on yksittäisten mikrobilajien merkitys suolistoterveydelle. Lisäksi on oleellista saada selville, toistuvatko tässä työssä löydetyt mikrobimuutokset myös laajemmassa ja suuremmalta maantieteelliseltä alueelta kerätyssä IBS-potilaiden suolistonäyteaineistossa.