Developmental-like responses in injured mature central neurons

Traumatic insults to the central nervous system are frequently followed by profound and irreversible neuronal loss as well as the inability of the damaged neurons to regenerate. One of the major therapeutic challenges is to increase the amount of surviving neurons after trauma. Thus it is crucial to understand how injury affects neuronal responses and which conditions are optimal for survival to prevent neuronal loss. During development neuronal survival is thought to be dependent on the competition for the availability of survival-promoting molecules called neurotrophic factors. Much less is known on the survival mechanisms of mature neurons under traumatic conditions. Increasing amount of evidence points towards the possibility that after injury neuronal responses might aquire some developmental characteristics. One of the important examples is the change in the responses to the neurotransmitter GABA: it is inhibitory in the intact mature neurons, but can induce excitation during development and after trauma. An important step in the maturation of GABAergic transmission in the CNS is the developmental shift in the action of GABAA receptor from depolarization in immature neurons to hyperpolarization in mature neurons. GABAA-mediated responses are tightly linked to the homeostasis of the chloride anion (Cl-), which in neurons is mainly regulated by Na+-K+-2Cl- cotransporter NKCC1 and K+-Cl- cotransporter KCC2. Trauma-induced functional downregulation of KCC2 promotes a shift from hyperpolarizing GABAA-mediated responses to depolarizing. Other important consequences of neuronal trauma are the emergence of dependency of central neurons on brain-derived neuro¬trophic factor (BDNF) for survival, as well as the upregulation of neurotrophin receptor p75NTR. Our aim was to answer the question whether these post-traumatic events are interrelated, and whether the regulation of BDNF and KCC2 expression is different under traumatic conditions and in intact neurons. To study responses of injured mature central neurons, we used an in vitro and in vivo axotomy models. For in vitro studies, we lesioned organotypic hippocampal slices between CA3 and CA1 regions, which resulted in selective axotomy of the CA3 neurons and denervation of the CA1 neurons. Some experiments were repeated in vivo by lesioning the neurons of the corticospinal tract at the internal capsule level, or by lesioning spinal motoneurons at the ventral root. We show that intact mature neurons do not require BDNF for survival, whereas in axotomized neurons apoptosis is induced upon BDNF deprivation. We further show that post-traumatic dependency on BDNF is mediated by injury-induced upregulation of p75NTR. Post-traumatic increase in p75NTR is induced by GABAA-mediated depolarization, consequent opening of voltage-gated Ca2+ channels, and the activation of Rho kinase ROCK. Thus, post-traumatic KCC2 downregulation leads to the dependency on BDNF through the induction of p75NTR upregulation. Neurons that survive after axotomy over longer period of time lose BDNF dependency and regain normal KCC2 levels. This phenomenon is promoted by BDNF itself, since after axotomy contrary to normal conditions KCC2 is upregulated by BDNF. The developmentally important thyroid hormone thyroxin regulates BDNF expression during development. We show that in mature intact neurons thyroxin downregulates BDNF, whereas after axotomy thyroxin upregulates BDNF. The elevation of BDNF expression by thyroxin promoted survival of injured neurons. In addition, thyroxin also enhanced axonal regeneration and promoted the regaining of normal levels of KCC2. Thus we show that this hormone acts at several levels on the axotomy-initiated chain of events described in the present work, and could be a potential therapeutic agent for the injured neurons. We have also characterized a previously unknown downregulatory interaction between thyroxin and KCC2 in intact neurons. In conclusion, we identified several important interactions at the neurotrophin-protein and hormone-neurotrophin level that acquire immature-like characteristics after axotomy and elucidated an important part of the mechanism by which axotomy leads to the requirement of BDNF trophic support. Based on these findings, we propose a new potential therapeutic strategy where developmentally crucial agents could be used to enhance survival and regeneration of axotomized mature central neurons.

Keskushermoston vauriotiloihin liittyy usein huomattava palautumaton hermosolukato. Tärkeimpiä tutkimuksen haasteita onkin lisätä eloonjääneiden hermosolujen määrää. Kehityksen aikana hermosolujen eloonjäämisen tiedetään riippuvan hermokasvutekijöistä, mm. aivoperäisestä hermokasvutekijästä (BDNF:sta). Kypsien hermosolujen elonjäämistä säätelevistä mekanismeista vaurion yhteydessä tiedetään kuitenkin paljon vähemmän. Trauman jälkeen hermosolujen vasteet näyttävät väliaikaisesti saavan kehityksenaikaisia ominaisuuksia. Tärkeä esimerkki on muutos vasteissa välittäjäaine GABA:lle. GABA on ärsytystä estävä (hyperpolarisoiva) terveissä kypsissä hermosoluissa, mutta toimii ärsytystä lisäävänä (depolarisoivana) kehittyvissä hermosoluissa. Trauman jälkeen GABA on depolarisoiva myös kypsissä neuroneissa. GABA:n virheetön toiminta edellyttää tiukkaa kloriditasapainoa, joka vuorostaan riippuu mm kalium-kloridikotransportteri KCC2:sta. Vaurion jälkeen KCC2:n ilmentyminen hermosoluissa pienenee johtaen siihen että vasteet GABA:lle muuttuvat depolarisoiviksi. Tutkimuksessa selvittiin tämän muutoksen vaikutuksia hermosoluihin, sekä etsittiin mahdollisuuksia edistää niiden eloonjäämistä hermosolun viejähaarakkeen (aksonin) mekaanisen vaurion jälkeen. Tutkimuksessa käytettiin hiiren aivojen solunäytteitä, joille aiheutettiin mekaaninen aksonivaurio. Osa tärkeimmistä tuloksista toistettiin hiiri- ja rottamalleissa, joissa tutkittiin mekaanisen vaurion vaikutuksia kortikospinaaliradan hermosoluihin sekä selkäytimen mononeuroneihin. Tulokset osoittavat, että GABA:n aikaansaama depolarisaatio aiheuttaa hermokasvutekijäreseptori p75:n ekpressiotason lisääntymistä. Tämä puolestaan johtaa siihen, että vaurioituneet hermosolut tulevat riippuvaisiksi BDNF:sta. Havainto selittää sen, että vaurioituneissa neuroneissa BDNF:n puute johtaa ohjelmoituun solukuolemaan; kun taas terveet kypsät hermosolut, joissa GABA on hyperpolarisoiva, eivät tarvitse BDNF:a. Tutkimustulokset osoittavat, että nesteenpoistolääke bumetanidi, joka pystyy salpaamaan GABA-depolarisaation vaurioituneissa hermosoluissa, estää BDNF- riippuvuudesta johtuvaa hermosolujen kuolemaa. Bumetanidin käyttömahdollisuuksia vaurioituneen keskushermoston hoidossa on syytä jatkossa tutkia laajemmin. Kehityksellisesti tärkeä hormoni tyroksiini lisää BDNF:n ilmentymistä epäkypsissä hermosoluissa. Tulostemme mukaan tyroksiini lisää BDNF:n ilmentymistä myös vauriotuneissa hermosoluissa. Koska nämä ovat riippuvaisia BDNF:sta, lisää tyroksiini täten vaurioituneiden hermosolujen eloonjäämistä. Lisäksi tutkimuksessamme tyroksiini lisäsi hermosolujen regeneraatiota sekä edisti normaalin KCC2:n ekspression saavuttamista. Tulokset rohkaisevat lisätutkimuksiin tyroksiinin terapeuttisesta potentiaalista vaurioituneessa keskushermostossa. Työssä on kuvattu useita tärkeitä vuorovaikutuksia, jotka saavat kehityksenaikaisia piirteitä aksonivaurion jälkeen, sekä selvitetty miten vaurionjälkeinen muutos GABA:n signaloinnissa vaikuttaa hermosolujen eloonjäämiseen. Tulosten pohjalta voidaan mahdollisesti kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja, joissa hermosolujen eloonjäämistä edistetään GABA-järjestelmään vaikuttavien lääkkeiden kautta, sekä käytetään kehityksellisesti tärkeitä molekyylejä edistämään vaurioituneen keskushermoston paranemista.