Molecular characterization of sediment bacterial communities affected by fish farming

Fish farming introduces nutrients, microbes and a wide variety of chemicals such as heavy metals, antifoulants and antibiotics to the surrounding environment. Introduction of antibiotics has been linked with the increased incidence of antibiotic resistant pathogenic bacteria in the farm vicinities. In this thesis molecular methods such as quantitative PCR and DNA sequencing were applied to analyze bacterial communities in sediments from fish farms and pristine locations. Altogether four farms and four pristine sites were sampled in the Baltic Sea. Two farm and two pristine locations were sampled over a surveillance period of four years. Furthermore, a new methodology was developed as a part of the study that permits amplifying single microbial genomes and capturing them according to any genetic traits, including antibiotic resistance genes. The study revealed that several resistance genes for tetracycline were found at the sediment underneath the aquaculture farms. The copy number of these genes remained elevated even at a farm that had not used any antibiotics since year 2000, six years before this study started. Similarly, an increase in the amount of mercury resistance gene merA was observed at the aquaculture sediment. The persistence of the resistance genes in absence of any selection pressure from antibiotics or heavy metals suggests that the genes may be introduced to the sediment by the farming process. This is also supported by the diversity pattern of the merA gene between farm and pristine sediments. The bacterial community-level changes in response to fish farming were very complex and no single phylogenetic groups were found that would be typical to fish farm sediments. However, the community structures had some correlation with the exposure to fish farming. Our studies suggest that the established approaches to deal with antibiotic resistance at the aquaculture, such as antibiotic cycling, are fundamentally flawed because they cannot prevent the introduction of the resistance genes and resistant bacteria to the farm area by the farming process. Further studies are required to study the entire fish farming process to identify the sources of the resistance genes and the resistant bacteria. The results also suggest that in order to prevent major microbiological changes in the surrounding aquatic environment, the farms should not be founded in shallow water where currents do not transport sedimenting matter from the farms. Finally, the technique to amplify and select microbial genomes will potentially have a considerable impact in microbial ecology and genomics.

Kalankasvatuksen yhteydessä meriympäristöön vapautuu ravinteita, mikrobeita, raskasmetalleja, pilaantumisenestoaineita sekä antibiootteja. Antibioottien sekä muiden edellä mainittujen aineiden yhteisvaikutuksesta kasvattamoiden lähiympäristössä on havaittu korkeita määriä antibiooteille vastustuskykyisiä bakteereita. Tässä väitöskirjatyössä sovellettiin molekyylimenetelmiä (kvantitatiivinen PCR ja DNA-sekvensointi) selvittämään kalankasvatuksen vaikutusta kasvattamoiden alla olevan sedimentin bakteeriyhteisöihin. Kaikkiaan neljältä kasvattamolta ja neljältä puhtaalta paikalta Itämeressä kerättiin sedimenttinäytteitä. Kahdelta kasvattamolta ja puhtaalta paikalta näytteitä kerättiin neljän peräkkäisen vuoden ajan. Lisäksi työn aikana kehitettiin uudenlainen menetelmä yksittäisten mikrobisolujen genomien monistamiseen ja seulomiseen geneettisten ominaisuuksien perusteella. Tutkimuksessa kasvattamoiden alla olevasta sedimentistä löydettiin kohonneita määriä useita geenejä, jotka antavat vastustuskyvyn tetrasykliini-antibiootille. Kyseisten geenien määrä pysyi jatkuvasti kohonneena jopa kasvattamolla, joka oli lopettanut kaikkien antibioottien käytön jo vuonna 2000; kuusi vuotta ennen tämän tutkimuksen alkua. Samankaltainen ilmiö havaittiin myös elohopealle sietokyvynkyvyn antavalla merA-geenillä, jota löytyi kalankasvatukselle altistuneista sedimenteistä enemmän kuin muista sedimenteistä. Geenien korkea määrä sekä merA-geenin DNA-sekvenssityyppien jakautuminen viittaa siihen, että geenit saattavat tulla kasvattamoiden sedimenttiin kasvatusprosessin seurauksena. Kalankasvatus ei aiheuttanut selvästi tyypillisiä muutoksia sedimentin bakteeriyhteisöissä. Yhteisön rakenteessa tapahtui kuitenkin tietynlaisia muutoksia, jotka olivat yhteydessä viljelyn suuruusluokkaan. Tutkimuksessa saadut tulokset viittaavat siihen, että kalankasvattamoilla perinteisesti käytetyt menetelmät, erityisesti antibioottikierto, ovat tehottomia antibiooteille vastustuskykyisten bakteerien määrän hallitsemiseksi, sillä ne eivät estä kalankasvatusprosessin aikaisemmista vaiheista tulevien resistenssigeenien ja resistenttien bakteereiden päätymistä kasvattamoille. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään, mikä vaihe kalankasvatusprosessissa saa aikaan antibiooteille vastustuskyvyn antavien geenien leviämisen. Tulosten mukaan merkittävien mikrobiologisten yhteisömuutoksien välttämiseksi sedimentissä kalankasvattamoita ei tulisi perustaa matalaan veteen, missä virtaukset eivät pääse sekoittamaan sedimenttiä. Tutkimuksen yhteydessä kehitetyllä mikrobigenomien monistuksen ja seulomisen mahdollistavalla menetelmällä tulee mahdollisesti olemaan merkittävä vaikutus tuleviin mikrobiekologisiin ja genomisiin tutkimuksiin.