The effects of abiotic and biotic factors on somatic embryogenesis and seedlings of Pinus sylvestris (L.)

Somatic embryogenesis (SE) is an asexual form of plant propagation that occurs in nature and mimics many of the events of sexual reproduction. Pinus sylvestris (L.) is an important source of timber in Northern Eurasia but it is recalcitrant to somatic embryogenesis. Several factors important for the success of the P. sylvestris embryogenic cultures have not been thoroughly investigated. In this study, we examined the effects of parental genotypes on the SE in P. sylvestris, the involvement of the gaseous plant growth regulator, ethylene in SE, and also biotic effects on somatic embryos as well as on seedlings. We tested parental effects on immature embryo initiation for different media, storage periods, and on the maturation process. Maternal effects were found to be crucial for SE in the absence of paternal effects. No maternal-paternal interaction was observed at any stage of somatic embryo production. Additionally the role of ethylene at different developmental stages of SE was investigated. Two ACC synthase genes, PsACS1 and PsACS2, were isolated and characterized. PsACS1 was expressed during the proliferation stage in all tested genotypes, whereas PsACS2 was only expressed in somatic embryos of each genotype. Ethylene production in embryos at stage 3 was significantly higher than the other stages. In a parallel study, the response of somatic embryos to fungal elicitors was investigated. Three fungi, a mutualistic ectomycorrhizal (ECM) fungus (Suillus bovinus), a weak Scots pine pathogen (Heterobasidion parviporum) and a strong pathogen (H. annosum) were used. The gene expression patterns for embryos exposed to the H. parviporum elicitor were found to be similar to that documented for S. bovinus among the tested genes. By contrast somatic embryos exposed to the H. annosum elicitor had a different pattern of regulation which was marked by a delayed response, and in some cases death of the embryos. Furthermore, interaction without direct contact between P. sylvestris seedlings and microbes (mutualistic and pathogenic fungus, cyanobacterium) were investigated. Several novel genes expressed in seedlings treated with ECM fungus were isolated which suggested that physical contact is not necessary for elicitation of host responses. The results suggest that somatic embryos and seedlings of P. sylvestris are genetically well equipped to respond to fungal elicitor/exudates and could serve as a suitable model for reproducible molecular studies in conifer tree patho- and symbiotic systems.

Abioottisten ja bioottisten tekijöiden vaikutukset männyn (Pinus sylvestris L.) somaattiseen embryogeneesiin ja siementaimiin Somaattinen embryogeneesi (SE) on kasvin suvuton lisääntymistapa, jota esiintyy luonnossa ja joka jäljittelee monia suvulliseen lisääntymiseen liittyviä tapahtumia. Pinus sylvestris (L.) on merkittävä tuotantopuu pohjoisessa Euraasiassa, mutta sen somaattinen embryogeneesi on hankalasti toteutettavissa. Monia SE:n onnistumiselle tärkeitä tekijöitä ei ole tutkittu tarpeeksi. Tässä tutkimuksessa me tarkastelemme vanhempien genotyypin vaikutusta männyn SE:iin, kaasumaisen kasvunsäätäjän etyleenin osallistumista SE:iin ja etyleenin bioottisia vaikutuksia sekä somaattisiin alkioihin että siementaimiin. Testasimme vanhempien genotyypin vaikutusta epäkypsien alkioiden kasvuunlähtöön eri kasvatusalustoilla eri pituisten varastoiniaikojen jälkeen ja somaattisten alkioiden kypsymisvaiheessa. Isä-äiti yhteisvaikutusta ei havaittu missään somaattisten alkioiden kehitysvaiheessa. Tutkimme myös etyleenin roolia SE:n eri vaiheissa. Kaksi ACC-syntaasi geeniä, PsACS1 ja PsACS2, eristettiin ja karakterisoitiin. PsACS1 ekspressoitui proliferaatiovaiheessa kaikilla testatuilla genotyypeillä, kun taas PsACS2 ekspressoitui kaikkien genotyyppien somaattisissa alkioissa. Etyleenin tuotanto 3. vaiheen alkioissa oli huomattavasti korkeampi kuin muissa kehitysvaiheissa. Rinnakkaisessa kokeessa tutkimme myös somaattisten alkioiden reaktiota sienielisitoreihin. Kokeessa käytettiin kolmea sientä, symbionttista ektomykorritsasientä (ECM) Suillus bovinus, lievää männyn patogeenia Heterobasidion parviporum ja haitallista tuhosientä H. annosum. H. parviporum elisitorille altistettujen alkioiden geeniekspressiot todettiin samanlaisiksi kuin S. bovinus sienen aiheuttamat samoilla geeneillä. Sen sijaan somaattisilla alkioilla, jotka oli käsitelty S. bovinus sienen elisitoreilla oli erilainen toimintamalli, jota kuvaa hitaampi vastine ja joissain tapauksissa alkioiden kuolema. Lisäksi tutkittiin vuorovaikutusta ilman suoraa kontaktia männyn siementaimien ja mikrobien (symbionttiset ja patogeeniset sienet, syanobakteeri) välillä. Pystyimme eristämään useita uusia geenejä, jotka ekspressoituivat siementaimissa kun ne altistettiin ECM sienelle ilman suoraa kontaktia, mikä viittaa siihen että fyysinen kontakti ei ole tarpeen jotta saadaan aikaan vastine isäntäkasvissa. Saadut tulokset antavat viitteitä siitä, että männyn somaattiset alkiot ja siementaimet ovat geneettisesti kykeneviä vastaamaan sienten elisitoreihin/eritteisiin ja ne voivat tarjota sopivan mallin toistettaviin molekyylitason tutkimuksiin havupuiden ja patogeenien sekä symbionttisten sienten vuorovaikutuksista.