Adhesion,Presence and Antifouling of Deinococcus geothermalis in Paper Machine Environment

This thesis has two items: biofouling and antifouling in paper industry. Biofouling means unwanted microbial accumulation on surfaces causing e.g. disturbances in industrial processes, contamination of medical devices or of water distribution networks. Antifouling focuses on preventing accumulation of the biofilms in undesired places. Deinococcus geothermalis is a pink-pigmented, thermophilic bacterium, and extremely resistant towards radiation, UV-light and desiccation and known as a biofouler of paper machines forming firm and biocide resistant biofilms on the stainless steel surfaces. The compact structure of biofilm microcolonies of D. geothermalis E50051 and the adhesion into abiotic surfaces were investigated by confocal laser scanning microscope combined with carbohydrate specific fluorescently labelled lectins. The extracellular polymeric substance in D. geothermalis microcolonies was found to be a composite of at least five different glycoconjugates contributing to adhesion, functioning as structural elements, putative storages for water, gliding motility and likely also to protection. The adhesion threads that D. geothermalis seems to use to adhere on an abiotic surface and to anchor itself to the neighbouring cells were shown to be protein. Four protein components of type IV pilin were identified. In addition, the lectin staining showed that the adhesion threads were covered with galactose containing glycoconjugates. The threads were not exposed on planktic cells indicating their primary role in adhesion and in biofilm formation. I investigated by quantitative real-time PCR the presence of D. geothermalis in biofilms, deposits, process waters and paper end products from 24 paper and board mills. The primers designed for doing this were targeted to the 16S rRNA gene of D. geothermalis. We found D. geothermalis DNA from 9 machines, in total 16 samples of the 120 mill samples searched for. The total bacterial content varied in those samples between 107 to 3 ×1010 16S rRNA gene copies g-1. The proportion of D. geothermalis in those same samples was minor, 0.03 1.3 % of the total bacterial content. Nevertheless D. geothermalis may endanger paper quality as its DNA was shown in an end product. As an antifouling method towards biofilms we studied the electrochemical polarization. Two novel instruments were designed for this work. The double biofilm analyzer was designed for search for a polarization program that would eradicate D. geothermalis biofilm or from stainless steel under conditions simulating paper mill environment. The Radbox instrument was designed to study the generation of reactive oxygen species during the polarization that was effective in antifouling of D. geothermalis. We found that cathodic character and a pulsed mode of polarization were required to achieve detaching D. geothermalis biofilm from stainless steel. We also found that the efficiency of polarization was good on submerged, and poor on splash area biofilms. By adding oxidative biocides, bromochloro-5,5-dimethylhydantoin, 2,2-dibromo-2-cyanodiacetamide or peracetic acid gave additive value with polarization, being active on splash area biofilms. We showed that the cathodically weighted pulsed polarization that was active in removing D. geothermalis was also effective in generation of reactive oxygen species. It is possible that the antifouling effect relied on the generation of ROS on the polarized steel surfaces. Antifouling method successful towards D. geothermalis that is a tenacious biofouler and possesses a high tolerance to oxidative stressors could be functional also towards other biofoulers and applicable in wet industrial processes elsewhere.

Biofilmit, pintoihin tarttuvat ja niillä kasvavat mikrobit, ovat haitallisia kasvaessaan ihmisen kannalta väärissä ympäristöissä. Tällaisia ovat teollisuuden kosteat pinnat, joissa on biofilmit voivat hidastaa prosessien toimintaa (puhdistuskatkot), liata ja vahingoittaa prosessin laitteistoa (biokorroosio) ja pilata lopputuotteiden laatua. Väitöskirjassani tutkin biofilmiä muodostavan Deinococcus geothermalis-bakteerin kiinnittymistä teräs- ja lasipintoihin sekä sen esiintymistä paperi- ja kartonkikoneiden biofilmeissä. Haitallisista biofilmeistä pyritään pääsemään eroon. Me tutkimme biofilmin poistoa teräspinnoilta menetelmällä, jossa ruostumatonta terästä polarisoidaan sähköllä. Testibiofilminä tässä tutkimuksessa käytimme D. geothermalis-bakteeria. D. geothermalis-bakteerin muodostamaa pinkin väristä, sitkeää biofilmiä on aiemmissa tutkimuksissa löydetty paperitehtaiden märän pään roiskealueiden pinnoilta. Tutkin kvantitatiivisella PCR-menetelmällä D. geothermalis bakteerin esiintymistä 24:stä eri paperi-ja kartonkikoneista eristetyistä värillistä biofilmeistä ja saostumista sekä prosessivedestä että lopputuotteiden väriläiskistä. Näytteistä eristetystä DNA:sta tutkittiin D. geothermalis-bakteerin läsnäoloa mittaamalla sen 16S rRNA geenimäärää spesifisten alukkeiden avulla. Tutkimus paljasti, että tehtailta kerätyistä näytteistä vain 10 % sisälsi D. geothermalis-bakteerin DNA:ta. D. geothermalis-bakteerin 16S rRNA geenin osuus positiivisissa näytteissä oli pieni, vain 0.03 - 1.3 % bakteerien 16S rRNA geenien lukumäärästä. Tästä huolimatta D. geothermalis voi pilata lopputuotteiden laatua, sillä sitä löytyi satunnaisesti lopputuotteiden väriläiskistä. D. geothermalis-bakteeri kiinnittyy lujasti elottomiin pintoihin. Biofilmi muodossaan monet bakteerit tuottavat solunulkoista, polysakkaridia sisältävää lima-ainesta. D. geothermalis tuottaa solunulkoista lima-ainesta vain niukasti. Käytin fluoresenssileimattuja, hiilihydraattispesifisiä lektiinejä ja konfokaalilasermikroskooppia biofilmin rakenteellisen polysakkaridiaineksen ja kiinnittymisen tutkimiseen. Havaitsimme, että biofilmin polysakkaridipitoinen aines oli järjestäytynyt viiteen erilaiseen vyöhykkeeseen, jotka voivat auttaa bakteeria kiinnittymään elottomaan pintaan, toimivat biofilmin rakenteellisina osina tai mahdollisena vesivarastona sekä antavat suojaa biofilmin bakteereille. Elottomiin pintoihin ja toisiin soluihin kiinnittyessään D. geothermalis-solut tuottavat erityisiä tarttumisrihmoja. Selvitimme näiden tarttumisrihmojen rakennetta proteomiikan avulla. Rihmat sisälsivät neljää proteiinia, jotka ovat ominaisia tyypin IV pilin rakenteille. Rihmoja ei esiintynyt planktisilla soluilla mikä viittaa siihen, että solut käynnistävät niiden tuoton tarttuessaan pintaan. Aiemmin Deinococcus suvun bakteereilta tyypin IV pilia ei ole löydetty. Sähkökemiallista biofilmin poiston tutkimusta varten suunnittelimme ja rakensimme laboratorio-mittakaavaisen laitteiston Double Biofilm Analyzer (DBA) sekä RadBox laitteen. DBA-laite mahdollisti useiden eri sähkökäsittelyjen samanaikaisen tutkimisen. D. geothermalis-bakteeri kestää ionisoivaa ja ultraviolettisäteilyä, kuivuutta sekä monia biosideja. Tutkimustulokset osoittivat, että katodinen tai katodisesti painotettu pulssitettu (anodinen ja katodinen vuorottelu) polarisaatio irrottivat biofilmin tehokkaasti teräksen pinnalta nestepinnan alapuolella, mutta ei ilman ja nesteen rajapinnalta. Kun hapettavia biosideja (peretikkahappo, 2,2 dibromi-2-syanoasetamidi, bromi-kloori-5,5-dimetyylihydantoiiini) käytettiin yhdessä katodisesti painotetun, pulsittavan polarisaation kanssa, irtosi myös roiskealueiden deinokokki biofilmit. Osoitin Radbox-laitteella, että polarisaation aikana muodostuu happiradikaaleja. Radikaalien todentamiseen kehittämässämme menetelmässä hyödynnettiin happiradikaalien kanssa reagoivia fluoresoivia väriaineita, joiden fluoresoivaa signaalia mitattiin reaaliajassa. Happiradikaalit ovat reaktiivisia hapettimia ja sellaisina aiheuttavat solutuhoa. Radikaalien muodostuminen pinnalla on se tekijä, jonka oletamme aiheuttavan deinokokki biofilmien irtoamiseen sähköisesti polarisoidulta pinnalta. Sähkökemiallinen polarisaatio tarjoaakin vaihtoehdon ja/tai lisätehoa biosidien käytölle ja mekaanisella puhdistukselle eri teollisuusympäristöissä tapahtuvaan biofilmin poistoon.