Plexin B2 in mouse and zebrafish development

Plexins (plxn) are receptors of semaphorins (sema), which were originally characterized as axon guidance cues. Semaphorin-plexin signalling has now been implicated in many other developmental and pathological processes. In this thesis, my first aim was to study the expression of plexins during mouse development. My second aim was to study the function of Plexin B2 in the development of the kidney. Thirdly, my objective was to elucidate the evolutionary conservation of Plexin B2 by investigating its sequence, expression and function in developing zebrafish. I show by in situ hybridisation that plexins are widely expressed also in the non-neuronal tissues during mouse development. Plxnb1 and Plxnb2, for example, are expressed also in the ureteric epithelium, developing glomeruli and undifferentiated metanephric mesenchyme of the developing kidney. Plexin B2-deficient (Plxnb2-/-) mice die before birth and have severe defects in the nervous system. I demonstrate that they develop morphologically normal but hypoplastic kidneys. The ureteric epithelium of Plxnb2-/- kidneys has fewer branches and a lower rate of proliferating cells. 10% of the embryos show unilateral double ureters and kidneys. The defect in the branching is intrinsic to the epithelium as the isolated ureteric epithelium grown in vitro fails to respond to Glial-cell-line-derived neurotrophic factor (Gdnf). We prove by co-immunoprecipitation that Plexin B2 interacts with the Gdnf-receptor Ret. Sema4C, the Plexin B2 ligand, increases branching of the ureteric epithelium in controls but not in Plxnb2-/- kidney explants. These results suggest that Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in a positive manner, possibly through directly regulating the activation of Ret. I cloned the zebrafish orthologs of Plexin B2, Plexin B2a and B2b. The corresponding proteins contain the conserved domains the B-subfamily plexins. Especially the expression pattern of plxnb2b recapitulates many aspects of the expression pattern of Plxnb2 in mouse. Plxnb2a and plxnb2b are expressed, for example, in the pectoral fins and at the midbrain-hindbrain region during zebrafish development. The nearly complete knockdown of Plexin B2a alone or together with the 45% knockdown of Plexin B2b did not interfere with the normal development of the zebrafish. In conclusion, my thesis reveals that plexins are broadly expressed during mouse embryogenesis. It also shows that Sema4C-Plexin B2 signalling modulates the branching of the ureteric epithelium during kidney development, perhaps through a direct interaction with Ret. Finally, I show that the sequence and expression of Plexin B2a and B2b are conserved in zebrafish. Their knockdown does not, however, result in the exencephaly phenotype of Plxnb2-/- mice.

Kehitysbiologia tutkii sitä, miten solut, kudokset ja niistä muodostuvat elimet erilaistuvat ja kehittyvät hedelmöittyneestä munasolusta yksilöksi. Solujen välinen vuorovaikutus on keskeinen erilaistumista säätelevä tapahtuma. Pleksiinit (plexin, lyh. plxn) ovat suuria, solukalvon läpäiseviä reseptoriproteiineja, jotka aktivoituessaan säätelevät hermosolujen viejähaarakkeiden reitittymistä. Niiden on osoitettu säätelevän myös patologisia sekä muita kehitysbiologisia tapahtumia. Väitöskirjassani olen ensin selvittänyt pleksiinien ilmentymiskuvioita hiiren sikiönkehityksen aikana. Näiden tulosten perusteella olen tutkinut Pleksiini B2:n tehtäviä hiiren munuaisen kehityksen aikana. Seeprakala on hiiren ohella paljon käytetty malli kehitysbiologisten ilmiöiden ja sairauksien tutkimuksessa. Väitöskirjassani olen tutkinut Pleksiini B2:n sekvenssiä, ilmentymistä ja tehtäviä myös seeprakalan kehityksessä. Osoitan, että pleksiinit ilmentyvät laajasti ja spesifisesti hiiren kehityksen aikana myös hermoston ulkopuolella. Erityisesti Plxnb1 ja Plxnb2 ilmentyvät kehittyvässä munuaisessa. Munuainen kehittyy kahden kudostyypin, epiteelin ja mesenkyymin, välisen vuorovaikutuksen seurauksena, ja Plxnb1 että Plxnb2 ilmentyvät näissä kummassakin. Kun Pleksiini B2:n ilmentyminen estetään hiiressä, sikiöt kuolevat ennen syntymää ja ne kärsivät vaikeista keskushermoston ongelmista. Munuaisen kehityksessä Pleksiini B2:n puutos johtaa siihen, että munuaiset jäävät pieniksi, munuaisputki haarautuu vähemmän kuin normaalisti ja sen epiteelin solut jakautuvat normaalia hitaammin. 10 % sikiöissä on nähtävissä myös kaksoismunuainen. Nämä munuaisen kehityshäiriöt johtuvat viasta epiteelin erilaistumisessa. Työssä saatiin viitteitä myös siitä, että Pleksiini B2 on vuorovaikutuksessa munuaisen kehitykselle keskeisen Ret-reseptorin kanssa ja että se mahdollisesti sitä kautta säätelee munuaisputken haaroittumista. Osoitan myös, että haaroittumista Pleksiini B2:n kautta säätelevä molekyyli on Semaforiini 4C. Väitöskirjassani osoitan seeprakalalla olevan kaksi Pleksiini B2-proteiinia koodaavaa geeniä; plxnb2a ja plxnb2b. Ne ilmentyvät seeprakalan kehityksen aikana pitkälti samoissa kudoksissa kuin Plxnb2 hiiressä. Vaikka plxnb2a ja plxnb2b ilmentyvät laajalti sekä seeprakalan hermostossa että muissa kudoksissa, plxnb2a:n täydellinen ja plxnb2b:n osittainen poistaminen ei johda vakaviin kehityshäiriöihin. Väitöskirjani on tuottanut uutta kehitysbiologista tietoa, jota tarvitaan myös kehityshäiriöiden tai tautien syiden ja mekanismien ymmärtämiseksi. Esimerkiksi munuaisen kehityshäiriöt ovat suurin syy lasten krooniseen munuaisten vajaatoimintaan. Siten Semaforiini 4C-Pleksiini B2-signalointireitti voi osoittautua kliinisesti merkitykselliseksi.