Prognostic significance of cyclooxygenase-2 and associated molecules in gastric cancer

Background and aims: Low stage and curative surgery are established factors for improved survival in gastric cancer. However, not all low-stage patients have a good prognosis. Cyclooxygenase-2 (COX-2) is known to associate with reduced survival in several cancers, and has been shown to play an important role in gastric carcinogenesis. Since new and better prognostic markers are needed for gastric cancer, we studied the prognostic significance of COX-2 and of markers that associate with COX-2 expression. We also studied markers reflecting proliferation and apoptosis, and evaluated their association with COX-2. Our purpose was to construct an accurate prognostic model by combining tissue markers and clinicopathogical factors. Materials and methods: Of 342 consecutive patients who underwent surgery for gastric cancer at Meilahti Hospital, Helsinki University Central Hospital, 337 were included in this study. Low stages I to II were represented by 141 (42%) patients, and high stages III to IV by 196 (58%). Curative surgery was performed on 176 (52%) patients. Survival data were obtained from the national registers. Slides from archive tissue blocks were prepared for immunohistochemistry by use of COX-2, human antigen R (HuR), cyclin A, matrix metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2, MMP-9), and Ki-67 antibodies. Immunostainings were scored by microscopy, and scores were entered into a database. Associations of tumor markers with clinicopathological factors were calculated, as well as associations with p53, p21, and results of flow cytometry from earlier studies. Survival analysis was performed by the Kaplan-Meier method, and Cox multivariate models were reconstructed. Cell culture experiments were performed to explore the effect of small interfering (si)RNA of HuR on COX-2 expression in a TMK-1 gastric cancer cell line. Results: Overall 5-year survival was 35.1%. Study I showed that COX-2 was an independent prognostic factor, and that the prognostic impact of COX-2 was more pronounced in low-stage patients. Cytoplasmic HuR expression also associated with reduced survival in gastric cancer patients in a non-independent manner. Cell culture experiments showed that HuR can regulate COX-2 expression in TMK-1 cells in vitro, with an association also between COX-2 and HuR tissue expression in a clinical material. In Study II, cyclin A was an independent prognostic factor and was associated with HuR expression in the gastric cancer material. The results of Study III showed that epithelial MMP-2 associated with survival in univariate, but not in multivariate analysis. However, MMP-9 showed no prognostic value. MMP-2 expression was associated with COX-2 expression. In Study IV, the prognostic power of COX-2 was compared with that of all tested markers associated with survival in Studies I to III, as well as with p21, p53, and flow cytometry results. COX-2 and p53 were independent prognostic factors, and COX-2 expression was associated with that of p53 and Ki-67 and also with aneuploidy. Conclusions: COX-2 is an independent prognostic factor in gastric cancer, and its prognostic power emerges especially in low stage cancer. COX-2 is regulated by HuR, and is associated with factors reflecting invasion, proliferation, and apoptosis. In an extended multivariate model, COX-2 retained its position as an independent prognosticator. COX-2 can be considered a promising new prognostic marker in gastric cancer.

Mahasyövän esiintyvyys ja sen aiheuttamat syöpäkuolemat ovat vähentyneet maailmanlaajuisesti viimeisten vuosikymmenten aikana. Suomessa diagnosoidaan alle 700 uutta mahasyöpää vuosittain, sairastuneista miesten osuus on kaksinkertainen naisiin verrattuna. Sosioekonomisten olojen parantumisen on ajateltu laskevan mahasyövän esiintyvyyttä, mutta tärkeimmäksi tekijäksi on kuitenkin katsottava Helicobacter pylorin löytyminen, sen merkityksen ymmärtäminen tämän syövän synnyssä, ja ennen kaikkea, sen häätö yhdistelmälääkehoidolla. Pääasialliset hyvän ennusteen tekijät ovat matala levinneisyysaste ja radikaali kirurginen hoito. Diagnostiikassa oleellisinta on sen varhaisuus. Mahalaukun tähystys koepaloineen, sekä tietokonetomografiatutkimus levinneisyyden selvittelyssä ovat oleellisimmat diagnostiset toimenpiteet. Kirurginen hoito sisältää mahalaukun poiston joko osittain tai kokonaan, sekä ympäröivien imusolmukkeiden poiston. Sytostaatti- eli syöpälääkehoitoa annetaan vain osalle potilaista toteutettuna joko sekä ennen että jälkeen leikkauksen, pelkästään leikkauksen jälkeen, tai yhdistettynä sädehoitoon. Ei kuitenkaan tiedetä tarkasti, miksi potilailla, joilla on samassa vaiheessa todettu ja samalla tavalla hoidettu syöpä, on erilainen taudinkulku ja ennuste. Siksi onkin tärkeää löytää uusia mitattavia ennusteellisia tekijöitä, kasvainmerkkiaineita, jotta oikeat potilaat valikoituisivat näihin usein varsin raskaisiin hoitoihin. Syklo-oksigenaasi-2 (cyclooxygenase-2, COX-2) on avainentsyymi tulehdusreaktion synnyssä. Se muuntaa arakidonihaposta prostaglandiiineja, jotka aiheuttavat tulehdusreaktion elimistössä. Fysiologisten vaikutusten lisäksi COX-2:n on todettu aiheuttavan mahasuolikanavan kasvaimia koe-eläimissä. COX-2 estää ohjelmoitua solukuolemaa eli apoptoosia, stimuloi uudisverisuonten muodostumista ja lisää niiden entsyymien tuotantoa, jotka puolestaan lisäävät etäpesäkkeiden syntyä. Näin ollen COX-2 on tärkeä mahasyövän syntyyn vaikuttava tekijä. Ennusteellisena tekijänä sen on todettu toimivan useissa muissa syövissä, kuten rinta-, paksusuoli-, ruokatorvi- ja haimasyövässä. COX-2:a voidaan salvata aspirinilla ja muilla tulehduskipulääkkeillä. Viimeaikaiset, laajat epidemiologiset tutkimukset ovat paljastaneet, että yli 75 mg aspirinia vuorokaudessa käyttävillä potilailla on verrokkeja merkittävästi pienempi riski sairastua ja kuolla maha-suolikanavan syöpään. Tämän väitöstutkimuksen tarkoituksena oli selvittää COX-2:n ja siihen liittyvien molekyylien merkitys mahasyövän ennusteeseen, sekä muodostaa näistä tekijöistä laskennallinen, ennusteellinen malli. Meilahden sairaalassa vuosina 1983-1999 mahasyövän vuoksi leikatuista 342 potilaasta 337 otettiin mukaan tähän tutkimukseen. Potilaiden mediaani-ikä oli 66 vuotta, matalaa levinneisyyttä (stage I-II) edusti 141 (42%) potilasta ja korkeaa (stage III-IV) 196 (58%). Radikaali, parantava leikkaus päästiin tekemään 176:lle potilaalle (52%). Kuolleisuustiedot saatiin valtakunnallisista rekistereistä. Leikkauspreparaateista tehtyjä paraffiiniblokkeja käyttäen kunkin potilaan syöpäkudosta värjättiin immunohistokemiallisin menetelmin. Värjäykset suoritettiin vasta-aineilla, jotka ilmensivät kasvainmerkkiaineista COX-2, lähetti RNA:ta stabiloivaa proteiinia HuR, solunjakautumista säätelevää proteiinia cyclin A, solukalvoja pilkkovia gelatinaaseja MMP-2 ja MMP-9, sekä solujen jakautumisaktiivisuutta ilmentävää proteiinia Ki-67. Lisäksi hyödynnettiin aiemmin määritettyjä värjäyksiä p53- ja p21- proteiineista, jotka osaltaan säätelevät solunjakautumista, sekä virtaussytometrialla määritettyjä muuttujia kunkin kasvaimen kasvupotentiaalista (S-phase fraction ja DNA ploidy). HuR:n kautta tapahtuvaa COX-2:n säätelyä mahasyöpäsoluissa (TMK-1) tutkittiin soluviljelytöillä. Immunohostokemialliset värjäykset tutkittiin mikroskoopilla ja luokiteltiin erillisten periaatteiden mukaan. Saadut numeeriset arvot syötettiin tietokantaan ja laskettiin näiden värjäystulosten korrelaatio potilaskohtaisiin, kliinispatologisiin muuttujiin, kuten ikä, sukupuoli, taudin levinneisyys, histologinen tyypitys ja leikkaustyyppi. Lisäksi määritettiin kunkin kasvainmerkkiaineen esiintymisen korrelaatio potilaiden elossaololukuihin, ja verrattiin merkkiaineiden ennusteellista merkitystä toisiinsa sekä kliinispatologisiin muuttujiin. Viisivuotiselossaololuku koko aineistossa oli 35.1%. Mahasyövän huonoon ennusteeseen korreloivat korkea levinneisyysaste, ei-radikaali leikkaus, sekä COX-2, HuR, cyclin A ja MMP-2. Erillisissä osatöissä suoritetuissa monimuuttuja-analyyseissä itsenäisinä ennustetekijöinä toimivat COX-2 ja cyclin A, mutta kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt muuttujat huomioivassa monimuuttujamallissa kasvainmerkkiaineista ainoastaan COX-2 ja p53 säilyivät itsenäisinä ennustetekijöinä. Lisäksi havaittiin, että COX-2:n ennusteellinen merkitys on suurempi varhaisvaiheen mahasyövissä, jotka yleensä ovat kirurgisesti hoidettavissa. Soluviljelytöissä kävi ilmi, että HuR säätelee COX-2:n tuotantoa solun sisällä. COX-2 on lupaava kasvainmerkkiaine mahasyövässä, ja sen ennusteellisen merkityksen painottuminen varhaisvaiheen syöpiin kertoo näiden kasvainten aggressiivisesta kasvutaipumuksesta. Ne varhaisvaiheen syöpää sairastava potilaat, joiden kasvaimista löytyy korkeat COX-2 -pitoisuudet, saattaisivat eniten hyötyä leikkaushoidon lisäksi annettavista syöpälääkehoidoista. Erityisen kiinnostavaa on mahdollisuus salvata COX-2:a aspiriinilla ja muilla tulehduskipulääkkeillä. Tulevaisuudessa onkin syytä tutkia laajemmin COX-2:n ja mahasyövän lääkehoitojen yhteyksiä.