The Structure and Functions of Hantavirus Nucleocapsid Protein

Hantaviruses, members of the genus Hantavirus in the Bunyaviridae family, are enveloped single-stranded RNA viruses with tri-segmented genome of negative polarity. In humans, hantaviruses cause two diseases, hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and hantavirus pulmonary syndrome (HPS), which vary in severity depending on the causative agent. Each hantavirus is carried by a specific rodent host and is transmitted to humans through excreta of infected rodents. The genome of hantaviruses encodes four structural proteins: the nucleocapsid protein (N), the glycoproteins (Gn and Gc), and the polymerase (L) and also the nonstructural protein (NSs). This thesis deals with the functional characterization of hantavirus N protein with regard to its structure. Structural studies of the N protein have progressed slowly and the crystal structure of the whole protein is still not available, therefore biochemical assays coupled with bioinformatical modeling proved essential for studying N protein structure and functions. Presumably, during RNA encapsidation, the N protein first forms intermediate trimers and then oligomers. First, we investigated the role of N-terminal domain in the N protein oligomerization. The results suggested that the N-terminal region of the N protein forms a coiled-coil, in which two antiparallel alpha helices interact via their hydrophobic seams. Hydrophobic residues L4, I11, L18, L25 and V32 in the first helix and L44, V51, L58 and L65 in the second helix were crucial for stabilizing the structure. The results were consistent with the head-to-head, tail-to-tail model for hantavirus N protein trimerization. We demonstrated that an intact coiled-coil structure of the N terminus is crucial for the oligomerization capacity of the N protein. We also added new details to the head-to-head, tail-to-tail model of trimerization by suggesting that the initial step is based on interaction(s) between intact intra-molecular coiled-coils of the monomers. We further analyzed the importance of charged aa residues located within the coiled-coil for the N protein oligomerization. To predict the interacting surfaces of the monomers we used an upgraded in silico model of the coiled-coil domain that was docked into a trimer. Next the predicted target residues were mutated. The results obtained using the mammalian two-hybrid assay suggested that conserved charged aa residues within the coiled-coil make a substantial contribution to the N protein oligomerization. This contribution probably involves the formation of interacting surfaces of the N monomers and also stabilization of the coiled-coil via intramolecular ionic bridging. We proposed that the tips of the coiled-coils are the first to come into direct contact and thus initiate tight packing of the three monomers into a compact structure. This was in agreement with the previous results showing that an increase in ionic strength abolished the interaction between N protein molecules. We also showed that residues having the strongest effect on the N protein oligomerization are not scattered randomly throughout the coiled-coil 3D model structure, but form clusters. Next we found evidence for the hantaviral N protein interaction with the cytoplasmic tail of the glycoprotein Gn. In order to study this interaction we used the GST pull-down assay in combination with mutagenesis technique. The results demonstrated that intact, properly folded zinc fingers of the Gn protein cytoplasmic tail as well as the middle domain of the N protein (that includes aa residues 80 248 and supposedly carries the RNA-binding domain) are essential for the interaction. Since hantaviruses do not have a matrix protein that mediates the packaging of the viral RNA in other negatve stranded viruses (NSRV), hantaviral RNPs should be involved in a direct interaction with the intraviral domains of the envelope-embedded glycoproteins. By showing the N-Gn interaction we provided the evidence for one of the crucial steps in the virus replication at which RNPs are directed to the site of the virus assembly. Finally we started analysis of the N protein RNA-binding region, which is supposedly located in the middle domain of the N protein molecule. We developed a model for the initial step of RNA-binding by the hantaviral N protein. We hypothesized that the hantaviral N protein possesses two secondary structure elements that initiate the RNA encapsidation. The results suggest that amino acid residues (172-176) presumably act as a hook to catch vRNA and that the positively charged interaction surface (aa residues 144-160) enhances the initial N-RNA interacation. In conclusion, we elucidated new functions of hantavirus N protein. Using in silico modeling we predicted the domain structure of the protein and using experimental techniques showed that each domain is responsible for executing certain function(s). We showed that intact N terminal coiled-coil domain is crucial for oligomerization and charged residues located on its surface form a interaction surface for the N monomers. The middle domain is essential for interaction with the cytoplasmic tail of the Gn protein and RNA binding.

Hantavirusten nukleokapsidiproteiinin rakenne ja toiminta Hantavirukset kuuluvat Bunyaviridae-perheen Hantavirus-sukuun ja ovat vaipallisia yksisäikeisiä RNA-viruksia, joilla on kolmiosainen polariteetiltaan negatiivinen genomi. Ihmisissä hantavirukset aiheuttavat kahta tautia, munuaisoireista verenvuotokuumetta (hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS) ja hantaviruskeuhko-oireyhtymää (hantavirus pulmonary syndrome, HPS), joiden vaikeusaste vaihtelee aiheuttajaviruksesta riippuen. Nephropathia epidemica (NE), eli myyräkuume on lievä HFRS-tauti ja hyvin yleinen Suomessa. Kullakin hantaviruksella on oma isäntäjyrsijänsä, jonka eritteistä virus tarttuu ihmiseen. Hantavirusten genomi koodittaa neljää rakenneproteiinia: nukleokapsidiproteiinia (N), glykoproteiineja (Gn ja Gc), ja polymeraasia (L) sekä nonstrukturaalista proteiinia (NSs). Tämä väitöskirja selvittää hantavirusten toimintaa suhteessa rakenteeseen. N-proteiinin rakenteen tutkimus on edistynyt hitaasti eikä koko proteiinin kiderakennetta ole vielä selvitetty. Näin ollen biokemialliset analyysit liitettynä bioinformatiikan mallinnukseen ovat olleet olennaisia N-proteiinin rakenteen ja toiminnan tutkimuksessa. Ilmeisesti RNA:n liittyessä viruksen kapsidiin N-proteiini muodostaa ensin trimeerejä ja sitten oligomeerejä. Tutkimme aluksi N-proteiinin aminoterminaalisen jakson osuutta N-proteiinin oligomerisoituessa. Tulokset viittasivat siihen, että N-proteiinin aminoterminaalinen jakso muodostaa kierteinen-kierre-rakenteen (coiled-coil), joka on olennainen N-proteiinin kyvylle oligomerisoitua. Kierteinen kierre syntyy kahden vastakkaissuuntaisen alfa-kierteen sitoutuessa hydrofobisella saumalla. Paikallistimme tätä rakennetta stabiloivat aminohapot. Tulokset sopivat “pää-päähän” ja” häntä-häntään” malliin N-proteiinin trimerisoituessa. Täydensimme tätä trimerisaation mallia siten, että alkuvaiheessa intaktit molekyylien sisäiset kierre-kierre sidokset ovat olennaisia. Määritimme myös kierteinen-kierre–rakenteen varattujen aminohappojen merkityksen N-proteiinin oligomerisaatiossa. Tietokone-avusteisessa in silico mallissa kolmea trimeeriksi liittynyttä kierre-kierre–rakennetta käytettiin ennustamaan sitoutumispinnat, jonka jälkeen mutatoimme näitä ennustettuja aminohappoja. Tulosten mukaan kierre-kierteen konservoidut varatut aminohapot osallistuvat keskeisesti N-proteiinin oligomerisatioon. Ehdotimme, että kierre-kierteen kärjet muodostavat alkukontaktin ja täten laukaisevat kolmen monomeerin pakkautumisen kiinteäksi rakenteeksi. Tämä sopi aiempiin havaintoihin, että ionivahvuuden lisäys poistaa N-proteiinimolekyylien välisen sitotumisen. Osoitimme myös, että aminohapot, joila on suurin vaikutus N-proteiinien oligomerisaatioon eivät ole hajallaan kierre-kierteisessä 3D-mallissa vaan muodostavat rykelmiä. Työssä todistettiin myös N-proteiinin sitoutuvan glykoproteiini Gn:n sytoplasmiseen häntään. Tätä sitoutumista tutkimme käyttäen ns. GST-pull-down-menetelmää mutageneesiin liitettynä. Tulostemme mukaan Gn-proteiinin sytoplasmisen hännän intaktit, oikealla tavalla laskostuneet sinkkisormet (zinc fingers) sekä N-proteiinin keskiosa ovat olennaisia sitoutumiselle. Koska hantaviruksilla ei ole matrix-proteiinia–välittämässä RNA:n pakkautumista kuten muilla negatiivi-säikeisillä RNA-viruksilla – hantavirusten ribonukleoproteiinin täytynee sitoutua suoraan virusvaippaan pedattujen glykoproteiinien viruksen sisäisiin osiin. Osoittaessamme N-Gn sitoutumisen saimme suoraa näyttöä viruksen synteesin keskeisestä vaiheesta ribonukleoproteiinien hakeutuessa viruksen muodostumiskohtiin soluissa. Lopuksi aloimme tutkia N-proteiinin sitoutumista virus-RNA:han, sitoutumisalue löytyy ilmeisesti N-proteiinin keskiosista. Kehitimme mallin tämän sitoutumisen alkuvaiheelle. Hypoteesimme mukaan hantaviruksen N-proteiinissa on kaksi sekundaarirakenteen elementtiä, jotka johtavat RNA:n joutumiseen kapsidirakenteeseen. Toisen niistä oletamme toimivan “koukkuna” kalastamaan virus-RNA ja toinen, positiivisesti varattu, oletettavasti lisää entisestään N-RNA -sitoutumista. Kaiken kaikkiaan, löysimme N-proteiinille uusia toimintoja. Ennustimme tietokonemallinnuksella (in silico) proteiinin domeenirakenteen ja osoitimme kokeellisesti kunkin domeenin osuuden tietyissä toiminnoissa. Osoitimme intaktin N–terminaalisen coiled-coil -domeenin keskeisen roolin oligomerisaatiossa ja että varatut aminohapot sen pinnalla muodostavat N-monomeereille sitoutumispinnan. Keskinen domeeni on olennainen N-proteiinin sitoutuessa Gn-glykoproteiinin sytoplasmiseen häntään ja virus-RNA:han.