Ultrastructure of Biofilms Formed by Bacteria from Industrial Processes

Microorganisms exist predominantly as sessile multispecies communities in natural habitats. Most bacterial species can form these matrix-enclosed microbial communities called biofilms. Biofilms occur in a wide range of environments, on every surface with sufficient moisture and nutrients, also on surfaces in industrial settings and engineered water systems. This unwanted biofilm formation on equipment surfaces is called biofouling. Biofouling can significantly decrease equipment performance and lifetime and cause contamination and impaired quality of the industrial product. In this thesis we studied bacterial adherence to abiotic surfaces by using coupons of stainless steel coated or not coated with fluoropolymer or diamond like carbon (DLC). As model organisms we used bacterial isolates from paper machines (Meiothermus silvanus, Pseudoxanthomonas taiwanensis and Deinococcus geothermalis) and also well characterised species isolated from medical implants (Staphylococcus epidermidis). We found that coating of steel surface with these materials reduced its tendency towards biofouling: Fluoropolymer and DLC coatings repelled all four biofilm formers on steel. We found great differences between bacterial species in their preference of surfaces to adhere as well as their ultrastructural details, like number and thickness of adhesion organelles they expressed. These details responded differently towards the different surfaces they adhered to. We further found that biofilms of D. geothermalis formed on titanium dioxide coated coupons of glass, steel and titanium, were effectively removed by photocatalytic action in response to irradiation at 360 nm. However, on non-coated glass or steel surfaces irradiation had no detectable effect on the amount of bacterial biomass. We showed that the adhesion organelles of bacteria on illuminated TiO2 coated coupons were complety destroyed whereas on non-coated coupons they looked intact when observed by microscope. Stainless steel is the most widely used material for industrial process equipments and surfaces. The results in this thesis showed that stainless steel is prone to biofouling by phylogenetically distant bacterial species and that coating of the steel may offer a tool for reduced biofouling of industrial equipment. Photocatalysis, on the other hand, is a potential technique for biofilm removal from surfaces in locations where high level of hygiene is required. Our study of natural biofilms on barley kernel surfaces showed that also there the microbes possessed adhesion organelles visible with electronmicroscope both before and after steeping. The microbial community of dry barley kernels turned into a dense biofilm covered with slimy extracellular polymeric substance (EPS) in the kernels after steeping in water. Steeping is the first step in malting. We also presented evidence showing that certain strains of Lactobacillus plantarum and Wickerhamomyces anomalus, when used as starter cultures in the steeping water, could enter the barley kernel and colonise the tissues of the barley kernel. By use of a starter culture it was possible to reduce the extensive production of EPS, which resulted in a faster filtration of the mash.

Mikrobit esiintyvät luonnossa etupäässä pintoihin kiinnittyneinä, useiden lajien muodostamina yhdyskuntina. Näitä liman verhoamia mikrobiyhteisöjä kutsutaan biofilmeiksi. Suurin osa mikrobilajeista pystyy muodostamaan biofilmejä. Biofilmejä esiintyy kaikilla pinnoilla, joilla on tarjolla tarpeeksi kosteutta ja ravinteita. Tällaisia pintoja on kaikkialla missä käsitellään vettä tai vesipitoisia nesteitä, kuten teollisuudessa ja vesijohtoverkossa. Biofilmin muodostus teollisuusprosesseissa voi heikentää laitteiden toimintakykyä ja lyhentää niiden käyttöikää, sekä aiheuttaa kontaminaatioita ja laadun heikenemistä tuotteisiin. Tästä syystä biofilmejä pyritään häätämään prosessilaitteista. Tutkin väitöskirjassani bakteerien tarttumista pinnoitetuille ja pinnoittamattomille teräspinnoille. Käytin koe-eliöinä paperikoneiden biofilmeistä eristettyjä bakteerilajeja, Meiothermus silvanus, Pseudoxanthomonas taiwanensis ja Deinococcus geothermalis, sekä lajia, joka tekee biofilmejä ihmisen elimistöön sijoitetuille esineille (implantit), Staphylococcus epidermidis. Löysin bakteerilajien väliltä suuria eroja sekä niiden kyvyssä tarttua eri pinnoille, että itse bakteerien pinnan rakenteissa. Turtkimani bakteerit osasivat myös sopeuttaa solurakenteensa eri pinnoilla, mm. tarttumaelimien paksuus ja lukumäärät olivat erilaisia. Käytin työssäni D. geothermalis -bakteerin muodostamia biofilmejä tutkiakseni, voidaanko ne irrottaa lasi- tai teräspinnoilta, jos pinnat pinnoitetaan titaanidioksidilla joka aktivoidaan 360 nm valolla. Tulokseni osoittivat, että näin saatiin aikaan biofilmiä tuhoava fotokatalyysi. Pinnoittamattomalla lasilla ja teräksellä biofilmin määrä pysyi muuttumattomana valaisusta riippumatta. Kun tutkin kenttäemissiopyyhkäisy-elektronimikroskoopilla biofilmejä TiO2 pinnoitetuilla pinnoilla, havaitsin että valokäsitellyillä pinnoilla bakteerien tarttumaelimet olivat tuhoutuneet, mutta pinnoittamattomilla pinnoilla ne näyttivät ehjiltä. Teräs on yleisin koneiden ja laitteiden materiaali monilla teollisuuden aloilla. Väitöskirjan tulokset kuitenkin näyttävät, että bakteerit tarttuvat hyvin juuri teräkseen. Samat tulokset saatiin hyvin erilaisilla, fylogeneettisesti kaukaisilla, bakteerilajeilla. Tulokset osoittivat myös, että teräksen alttiutta kerätä biofilmejä voidaan vähentää pinnoittamalla ja jos käytetään fotokatalyyttisesti aktiivista pinnoitetta, jo muodostuneetkin biofilmit voidaan poistaa valokäsittelyn avulla. Tutkin myös eläviin solukkoihin tarttuvia mikrobibiofilmejä. Tutkimuskohteena oli ohran jyvän luonnollinen biofilmi. Havaitsin että myös nämä biofilmit rakentuivat mikrobeista, joilla oli tarttumaelimiä. Ulkonäöltään tarttumaelimet muistuttivat niitä, joita olin löytänyt teräs- ja lasipinnoilta. Ohraa mallastettaessa kuivat jyvät liotetaan vedessä. Kun ohran jyvän biofilmiä tarkasteltiin elektronimikroskoopilla, havaittiin että likovaiheen aikana kuivien jyvien mikrobisto muuttui tiheäksi liman peittämäksi biofilmiksi. Tutkimukseni osoitti, että tätä limanmuodostusta voi vähentää lisäämällä likoveteen tiettyjä maitohappobakteereja (Lactobacillus plantarum) ja hiivoja (Wickerhamomyces anomalus). Nämä mikrobit pystyivät tunkeutumaan jyvän kuorikerroksen alle ja täyttämään pinnan, joka muuten olisi täyttynyt limaista biofilmiä tuottavilla mikrobeilla. Kun liman määrä väheni, niin mäskin suodatettavuus parani.