Cow's milk allergy and the development of tolerance

Aims: To gain insight on the immunological processes behind cow’s milk allergy (CMA) and the development of oral tolerance. To furthermore investigate the associations of HLA II and filaggrin genotypes with humoral responses to early oral antigens. Methods: The study population was from a cohort of 6209 healthy, full-term infants who in a double-blind randomized trial received supplementary feeding at maternity hospitals (mean duration 4 days): cow’s milk (CM) formula, extensively hydrolyzed whey formula or donor breast milk. Infants who developed CM associated symptoms that subsided during elimination diet (n=223) underwent an open oral CM challenge (at mean age 7 months). The challenge was negative in 112, and in 111 it confirmed CMA, which was IgE-mediated in 83. Patients with CMA were followed until recovery, and 94 of them participated in a follow-up study at age 8-9 years. We investigated serum samples at diagnosis (mean age 7 months, n=111), one year later (19 months, n=101) and at follow-up (8.6 years, n=85). At follow-up, also 76 children randomly selected from the original cohort and without CM associated symptoms were included. We measured CM specific IgE levels with UniCAP (Phadia, Uppsala, Sweden), and β-lactoglobulin, α-casein and ovalbumin specific IgA, IgG1, IgG4 and IgG levels with enzyme-linked immunosorbent assay in sera. We applied a microarray based immunoassay to measure the binding of IgE, IgG4 and IgA serum antibodies to sequential epitopes derived from five major CM proteins at the three time points in 11 patients with active IgE-mediated CMA at age 8-9 years and in 12 patients who had recovered from IgE-mediated CMA by age 3 years. We used bioinformatic methods to analyze the microarray data. We studied T cell expression profile in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) samples from 57 children aged 5-12 years (median 8.3): 16 with active CMA, 20 who had recovered from CMA by age 3 years, 21 non-atopic control subjects. Following in vitro β-lactoglobulin stimulation, we measured the mRNA expression in PBMCs of 12 T-cell markers (T-bet, GATA-3, IFN-γ, CTLA4, IL-10, IL-16, TGF-β, FOXP3, Nfat-C2, TIM3, TIM4, STIM-1) with quantitative real time polymerase chain reaction, and the protein expression of CD4, CD25, CD127, FoxP3 with flow cytometry. To optimally distinguish the three study groups, we performed artificial neural networks with exhaustive search for all marker combinations. For genetic associations with specific humoral responses, we analyzed 14 HLA class II haplotypes, the PTPN22 1858 SNP (R620W allele) and 5 known filaggrin null mutations from blood samples of 87 patients with CMA and 76 control subjects (age 8.0-9.3 years). Results: High IgG and IgG4 levels to β-lactoglobulin and α-casein were associated with the HLA (DR15)-DQB1*0602 haplotype in patients with CMA, but not in control subjects. Conversely, (DR1/10)-DQB1*0501 was associated with lower IgG and IgG4 levels to these CM antigens, and to ovalbumin, most significantly among control subjects. Infants with IgE-mediated CMA had lower β -lactoglobulin and α-casein specific IgG1, IgG4 and IgG levels (p<0.05) at diagnosis than infants with non-IgE-mediated CMA or control subjects. When CMA persisted beyond age 8 years, CM specific IgE levels were higher at all three time points investigated and IgE epitope binding pattern remained stable (p<0.001) compared with recovery from CMA by age 3 years. Patients with persisting CMA at 8-9 years had lower serum IgA levels to β-lactoglobulin at diagnosis (p=0.01), and lower IgG4 levels to β-lactoglobulin (p=0.04) and α-casein (p=0.05) at follow-up compared with patients who recovered by age 3 years. In early recovery, signal of IgG4 epitope binding increased while that of IgE decreased over time, and binding patterns of IgE and IgG4 overlapped. In T cell expression profile in response to β –lactoglobulin, the combination of markers FoxP3, Nfat-C2, IL-16, GATA-3 distinguished patients with persisting CMA most accurately from patients who had become tolerant and from non-atopic subjects. FoxP3 expression at both RNA and protein level was higher in children with CMA compared with non-atopic children. Conclusions: Genetic factors (the HLA II genotype) are associated with humoral responses to early food allergens. High CM specific IgE levels predict persistence of CMA. Development of tolerance is associated with higher specific IgA and IgG4 levels and lower specific IgE levels, with decreased CM epitope binding by IgE and concurrent increase in corresponding epitope binding by IgG4. Both Th2 and Treg pathways are activated upon CM antigen stimulation in patients with CMA. In the clinical management of CMA, HLA II or filaggrin genotyping are not applicable, whereas the measurement of CM specific antibodies may assist in estimating the prognosis.

Lehmänmaitoallergiaa esiintyy 2-3 %:lla imeväisistä. Valtaosa (80-90%) paranee eli alkaa sietää lehmänmaitoa 3-4 vuoden ikään mennessä. Väitöskirjatutkimuksessa selvitettiin lehmänmaitoallergiaan ja sen paranemiseen liittyviä immunologisia ilmiöitä. Tutkittiin myös, onko tietyillä immunologiaan liittyvillä perinnöllisyystekijöillä yhteyttä ruokavasta-aineiden muodostumiseen. Lehmänmaitoallergian hoitolinjojen valinnassa olisi olennaista kyetä ennustamaan, miten nopeasti potilas todennäköisesti paranee. Tähän ei toistaiseksi ole menetelmiä käytettävissä. Tutkimusaineistona oli 6207 tervettä, täysiaikaista vastasyntynyttä, joita seurattiin lehmänmaitoallergian kehittymisen suhteen. Lapsia, joilla (111:lla) todettiin lehmänmaitoallergia (keskimäärin 7 kk:n ikäisenä), seurattiin paranemiseen asti. Heistä 94 osallistui 8-9 vuoden iässä seurantatutkimukseen. Tuolloin 13 lasta oli vielä lehmänmaitoallergisia. Lisäksi mukaan otettiin 76 tervettä lasta alkuperäisestä väestöstä. Tutkimme seeruminäytteitä kolmesta aikapisteestä: diagnoosihetkellä (keskimäärin 7 kk:n ikäisenä), vuotta myöhemmin ja seurantatutkimuksen hetkellä (keskimäärin 8,6 v:n iässä). Mittasimme lehmänmaidon ja kananmunan valkuaisaineita vastaan kohdistuvien vasta-aineiden (IgE-, IgA-, IgG1, IgG4) seerumipitoisuuksia. Tutkimme myös, mihin lehmänmaidon valkuaisaineiden osiin (peptideihin) IgE- ja IgG4-vasta-aineet sitoutuivat. Valkosolunäytteistä tutkimme T-auttajasoluihin liittyvien tekijöiden ilmentymistä vasteena lehmänmaitoproteiinistimulaatiolle. Vertasimme tuloksia lapsien, joilla oli lehmänmaitoallergia vielä kouluiässä, ja niiden, jotka parantuivat aikaisemmin, välillä. Käytimme bioinformatiikan menetelmiä tulosten analysoimiseen. Perinnöllisistä tekijöistä selvitimme HLA II-alatyyppejä, sekä filaggriini- ja PTPN22-geenien muunnelmia 87 lehmänmaitoallergiapotilaalla ja 76 verrokilla. Havaitsimme, että perintötekijä HLA (DR15)-DQB1*0602 oli yhteydessä korkeisiin IgG ja IgG-vasteisiin lehmänmaitoproteiineille allergiapotilailla, mutta ei verrokeilla. Sen sijaan (DR1/10)-DQB1*0501 oli yhteydessä mataliin IgG ja IgG-vasteisiin lehmänmaidon ja kananmunan proteiineille, ennen kaikkea verrokeilla. Lapsilla, joilla oli lehmänmaitoallergia vielä 8-9-vuotiaina, oli korkeimmat lehmänmaitospesifiset IgE-tasot kaikissa kolmessa mittausaikapisteessä. Pitkittyneeseen lehmänmaitoallergiaan liittyi myös matalat lehmänmaitospesifiset IgA-tasot diagnoosihetkellä ja matalat spesifiset IgG4-tasot 8-9-vuotiaana. Varhaiseen paranemiseen liittyi nousevat lehmänmaitospesifiset IgG4-tasot yhdistettynä laskeviin vastaaviin IgE-tasoihin. Neljän T-auttajasoluihin liittyvän tekijän ilmentymisen yhdistelmä erotteli neuroverkkoanalyysin perusteella diagnoosihetkellä lapset, jotka paranivat leikki-ikäisinä, niistä, joiden lehmänmaitoallergia kesti pidempään. Säätelijä T-soluihin liittyvä tekijä (FoxP3) ilmentyi vahvemmin lehmänmaitoallergiapotilailla kuin verrokeilla. Lehmänmaitoallergian kliinisessä arvioinnissa HLA II- tai filaggriiniperinnöllisyystekijöiden selvittämisestä ei ole hyötyä. Sen sijaan lehmänmaitospesifisten vasta-aineiden määrittäminen voi auttaa sen ennustamisessa, kuinka nopeasti potilas lehmänmaitoallergiasta paranee. T2-auttajasolujen ja säätelijä-T-solujen toiminnan tasapaino vaikuttaa olennaiselta lehmänmaitoallergian paranemisessa.