Molecular Genetic Studies of Melanocortin Receptors in Morbid Obesity

The prevalence of obesity is increasing at an alarming rate in all age groups worldwide. Obesity is a serious health problem due to increased risk of morbidity and mortality. Although environmental factors play a major role in the development of obesity, the identification of rare monogenic defects in human genes have confirmed that obesity has a strong genetic component. Mutations have been identified in genes encoding proteins of the leptin-melanocortin signaling system, which has an important role in the regulation of appetite and energy balance. The present study aimed at identifying mutations and genetic variations in the melanocortin receptors 2-5 and other genes active on the same signaling pathway accounting for severe early-onset obesity in children and morbid obesity in adults. The main achievement of this thesis was the identification of melanocortin-4 receptor (MC4R) mutations in Finnish patients. Six pathogenic MC4R mutations (308delT, P299H, two S127L and two -439delGC mutations) were identified, corresponding to a prevalence of 3% in severe early-onset obesity. No obesity causing MC4R mutations were found among patients with adult-onset morbid obesity. The MC4R 308delT deletion is predicted to result in a grossly truncated nonfunctional receptor of only 107 amino acids. The C-terminal residues, which are important in MC4R cell surface targeting, are totally absent from the mutant 308delT receptor. In vitro functional studies supported a pathogenic role for the S127L mutation since agonist induced signaling of the receptor was impaired. Cell membrane localization of the S127L receptor did not differ from that of the wild-type receptor, confirming that impaired function of the S127L receptor was due to reduced signaling properties. The P299H mutation leads to intracellular retention of the receptor. The -439delGC deletion is situated at a potential nescient helix-loop-helix 2 (NHLH2) -binding site in the MC4R promoter. It was demonstrated that the transcription factor NHLH2 binds to the consensus sequence at the -439delGC site in vitro, possibly resulting in altered promoter activity. Several genetic variants were identified in the melanocortin-3 receptor (MC3R) and pro-opiomelanocortin (POMC) genes. These polymorphisms do not explain morbid obesity, but the results indicate that some of these genetic variations may be modifying factors in obesity, resulting in subtle changes in obesity-related traits. A risk haplotype for obesity was identified in the ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1 (ENPP1) gene through a candidate gene single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping approach. An ENPP1 haplotype, composed of SNPs rs1800949 and rs943003, was shown to be significantly associated with morbid obesity in adults. Accordingly, the MC3R, POMC and ENPP1 genes represent examples of susceptibility genes in which genetic variants predispose to obesity. In conclusion, pathogenic mutations in the MC4R gene were shown to account for 3% of cases with severe early-onset obesity in Finland. This is in line with results from other populations demonstrating that mutations in the MC4R gene underlie 1-6% of morbid obesity worldwide. MC4R deficiency thus represents the most common monogenic defect causing human obesity reported so far. The severity of the MC4-receptor defect appears to be associated with time of onset and the degree of obesity. Classification of MC4R mutations may provide a useful tool when predicting the outcome of the disease. In addition, several other genetic variants conferring susceptibility to obesity were detected in the MC3R, MC4R, POMC and ENPP1 genes.

Lihavuus on yleistynyt jatkuvasti viimeisten vuosikymmenten aikana. Se on yksi merkittävämmistä sairastavuuteen ja ennenaikaiseen kuolleisuuteen johtavista tekijöistä, joka altistaa muun muassa tyypin 2 diabetekselle, sydän- ja verisuonitaudeille, tietyille syöpätyypeille sekä keuhkojen toimintahäiriöille. Lihavuuden esiintyvyys on lisääntynyt huomattavasti myös lasten ja nuorten keskuudessa. Vaikka ympäristötekijöillä onkin keskeinen asema lihavuuden synnyssä, on ihmisellä pystytty osoittamaan harvinaisia lihavuuteen johtavia yhden geenin virheitä ruokahalua säätelevässä leptiini melanokortiinijärjestelmässä. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli etsiä suomalaisilta aikuisilta ja lapsilta sairaalloiselle lihavuudelle altistavia geneettisiä variaatioita ja mutaatioita melanokortiinireseptoreista 2 - 5 ja mahdollisista muista kandidaattigeeneistä, jotka sijaitsevat samoilla fysiologisilla säätelyreiteillä. Tässä tutkimuksessa osoitettiin seuraavat melanokortiini- 4 reseptori (MC4R) geenin mutaatiot: aminohappomuutokset S127L ja P299H sekä deleetiot -439delGC ja 308delT. Suomessa nämä mutaatiot selittävät noin 3 % varhaislapsuudessa alkaneesta vaikeasta lihavuudesta. Aikuisina sairaalloisen lihaviksi lihoneilta henkilöiltä MC4R-geenin mutaatiota ei löytynyt. Reseptorin toimintaa selvittävillä solutason tutkimuksilla pystyttiin osoittamaan, että S127L-mutaatio vaikuttaa MC4 reseptorin signalointiaktiivisuuteen. Deleetio 308delT muuttaa proteiinin lukukehystä ja keskeyttää proteiinisynteesin ennenaikaisesti. P299H-mutaatio aiheuttaa reseptorille niin pahan häiriön, ettei sitä kuljeteta lainkaan solukalvolle. MC4R-geenin -439delGC-deleetio sijaitsee säätelyalueella mahdollisessa NHLH2-transkriptiotekijän (nescient helix-loop-helix 2) sitoutumiskohdassa. Solutason kokein osoitettiin, että transkriptiotekijä NHLH2 sitoutuu tähän kyseiseen kohtaan ja näin ollen mahdollisesti vaikuttaa MC4R-geenin aktiivisuuteen. Tässä väitöskirjatyössä tunnistettiin useita perinnöllisiä variaatioita melanokortiini- 3 reseptori (MC3R) ja pro-opiomelanokortiini (POMC) geeneissä. Nämä geenivariaatiot eivät yksin aiheuta sairaalloista lihavuutta, mutta tutkimustulokset viittaavat siihen, että osa näistä geenivarianteista saattaa altistaa lihavuudelle. Lisäksi tässä väitöskirjatyössä on tutkittu usean lihavuuden kandidaattigeenin alueelta yhden emäksen variaatioita (SNP) ja selvitetty näiden SNP:ien yhteyttä lihavuuteen. Tämän menetelmän avulla tunnistettiin ektonukleotidi pyrofosfataasi fosfodiesteraasi 1 (ENPP1) geenissä kahden geenivariaation muodostama riskihaplotyyppi, joka assosioituu sairaalloiseen lihavuuteen aikuisilla. Tämän väitöskirjatutkimuksen tärkeimpiin havaintoihin kuuluu MC4R-geenin mutaatioiden osoitus ja näiden geenivirheiden solutason tutkimukset. MC4R-geenin mutaatiot selittävät noin 3 % varhaislapsuudessa alkaneesta vaikeasta lihavuudesta Suomessa. Maailmanlaajuisesti MC4R-geenin virheet selittävät 1-6 % sairaalloisesta lihavuudesta ja ovat yleisin perinnöllinen syy lihavuuden taustalla. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella voidaan todeta, että MC4R-geenin mutaation vaikeusaste on yhteydessä lihavuuden ilmiasuun. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin lisäksi useita lihavuudelle altistavia geenivariantteja MC3R-, MC4R-, POMC- ja ENPP1-geeneissä.