Interactions and turnover of the muscular dystrophy protein myotilin

The striated muscle sarcomere is a force generating and transducing unit as well as an important sensor of extracellular cues and a coordinator of cellular signals. The borders of individual sarcomeres are formed by the Z-disks. The Z-disk component myotilin interacts with Z-disk core structural proteins and with regulators of signaling cascades. Missense mutations in the gene encoding myotilin cause dominantly inherited muscle disorders, myotilinopathies, by an unknown mechanism. In this thesis the functions of myotilin were further characterized to clarify the molecular biological basis and the pathogenetic mechanisms of inherited muscle disorders, mainly caused by mutated myotilin. Myotilin has an important function in the assembly and maintenance of the Z-disks probably through its actin-organizing properties. Our results show that the Ig-domains of myotilin are needed for both binding and bundling actin and define the Ig domains as actin-binding modules. The disease-causing mutations appear not to change the interplay between actin and myotilin. Interactions between Z-disk proteins regulate muscle functions and disruption of these interactions results in muscle disorders. Mutations in Z-disk components myotilin, ZASP/Cypher and FATZ-2 (calsarcin-1/myozenin-2) are associated with myopathies. We showed that proteins from the myotilin and FATZ families interact via a novel and unique type of class III PDZ binding motif with the PDZ domains of ZASP and other Enigma family members and that the interactions can be modulated by phosphorylation. The morphological findings typical of myotilinopathies include Z-disk alterations and aggregation of dense filamentous material. The causes and mechanisms of protein aggregation in myotilinopathy patients are unknown, but impaired degradation might explain in part the abnormal protein accumulation. We showed that myotilin is degraded by the calcium-dependent, non-lysosomal cysteine protease calpain and by the proteasome pathway, and that wild type and mutant myotilin differ in their sensitivity to degradation. These studies identify the first functional difference between mutated and wild type myotilin. Furthermore, if degradation of myotilin is disturbed, it accumulates in cells in a manner resembling that seen in myotilinopathy patients. Based on the results, we propose a model where mutant myotilin escapes proteolytic breakdown and forms protein aggregates, leading to disruption of myofibrils and muscular dystrophy. In conclusion, the main results of this study demonstrate that myotilin is a Z-disk structural protein interacting with several Z-disk components. The turnover of myotilin is regulated by calpain and the ubiquitin proteasome system and mutations in myotilin seem to affect the degradation of myotilin, leading to protein accumulations in cells. These findings are important for understanding myotilin-linked muscle diseases and designing treatments for these disorders.

Lihaksen rakennetta ja toimintaa säätelevät useat valkuaisaineet, joiden avulla aktiini- ja myosiinisäikeiden tuottama supistusvoima synkronoidaan ja siirretään tukikudoksiin. Myotiliini on lihaksen rakenneproteiini ja osa lihaksen supistusyksikköä, sarkomeeriä. Myotiliinin perityt pistemutaatiot aikaansaavat luuranko- ja sydänlihaksen häiriöitä, eli myotilinopatioita. Vaikka myotilinopatian perinnöllinen tausta tunnetaan, on vielä selvittämättä, kuinka myotiliinin muutokset johtavat lihasten surkastumiseen. Solutasolla tiedämme, että myotilinopatiapotilailla on vakavia sarkomeerin rakennehäiriöitä, ja että viallisen myotiliinin ilmentäminen lihassoluissa johtaa sarkomeerirakenteen hajoamiseen. Tässä tutkimuksessa selvitettiin myotiliinin toimintamekanismeja. Myotiliinin päätehtävänä lienee aktiinisäikeiden yhteenliittäminen sarkomeerin Z-levyssä. Osoitimme, että myotiliinin immunoglobuliinin (Ig) kaltaisia rakenneyksiköitä eli domeeneja tarvitaan aktiinin säätelyyn. Nämä Ig domeenit ovat yhtenäisiä rakenneosia muiden myotiliiniperheen jäsenten kanssa. Tauteja aiheuttavat geenivirheet eivät kuitenkaan vaikuttane myotiliinin ja aktiinin väliseen vuorovaikutukseen. Lihasmassaa säädellään tarpeen mukaan ja esimerkiksi fyysinen harjoittelu kasvattaa lihaksia. Rasitusvastetta ja siihen liittyvää geenien luentaa säätelevät Z-levyn rakenneproteiinit. Häiriö proteiinien, kuten myotiliinin, vuorovaikutuksissa voi johtaa lihastauteihin. Selvitimme sydän- ja lihastaudeissa mutatoituneiden myotiliinin- ja FATZ-perheen proteiinien vuorovaikutusta Z-levyssä sijaitsevien Enigma proteiiniperheen jäsenten kanssa. Osoitimme, että myotiliini- ja FATZ-perheiden jäsenet sitovat Enigma proteiinien PDZ-domeenia uuden ja ainutlaatuisen luokka III:n PDZ:tä sitovan motiivin avulla. Näitä proteiinien vuorovaikutuksia voidaan säädellä fosforylaation avulla. Vuorovaikutukset ovat osa mekanismia, jolla lihassolun sisäinen viestintä tapahtuu. Myotilinopatioille tyypillisiä lihaksen rakennevirheitä ovat Z-levyn muutokset ja tiheän säiemäisen materiaalin keräytyminen. Kertymien syytä ja mekanismia ei tunneta, mutta yksi syy tähän voisi olla proteiinien puutteellinen hajoaminen. Osoitimme, että kalpaiini-proteaasi pilkkoo myotiliinin lihassoluissa ja että myotiliini hajoaa pienempiin rakenneosiin proteasomireitin välityksellä. Määritimme myös ensimmäisen toiminnallisen eron normaalin ja mutatoituneen myotiliinin välillä, sillä myotilinopatioissa mutatoitunut myotiliini hajoaa huomattavasti normaalia hitaammin. Lisäksi näytimme, että mikäli myotiliinin hajoamista estetään kemikaaleilla, seurauksena on proteiinikertymiä, jotka muistuttavat potilasnäytteissä nähtäviä muutoksia. Näiden tulosten perusteella ehdotamme taudin syntymekanismiksi mallia, jossa mutatoitunut myotiliini ei hajoa normaalisti vaan muodostaa kertymiä, jotka johtavat lihaksen rakenneosien hajoamiseen ja lihastautiin. Tulokset edesauttavat myotiliiniin liittyvien lihassairauksien ymmärtämistä ja lihassairauksien hoitoon tarkoitettujen lääkkeiden kehittämistä.