Human trypsinogens in the pancreas and in cancer

Human pancreatic juice contains two major trypsinogen isoenzymes called trypsinogen-1 and -2, or cationic and anionic trypsinogen, respectively. Trypsinogen isoenzymes are also expressed in various normal and malignant tissues. We aimed at developing monoclonal antibodies (MAbs) and time-resolved immunofluorometric methods recognizing human trypsinogen-1 and -2, respectively. Using these MAbs and methods we purified, characterized and quantitated trypsinogen isoenzymes in serum samples, ovarian cyst fluids and conditioned cell culture media. In sera from healthy subjects and patients with extrapancreatic disease the concentration of trypsinogen-1 is higher than that of trypsinogen-2. However, in acute pancreatitis we found that the concentration of serum trypsinogen-2 is 50-fold higher than in controls, whereas the difference in trypsinogen-1 concentration is only 15-fold. This suggested that trypsinogen-2 could be used as a diagnostic marker for acute pancreatitis. In human ovarian cyst fluids tumor-associated trypsinogen-2 (TAT-2) is the predominant isoenzyme. Most notably, in mucinous cyst fluids the levels of TAT-2 were higher in borderline and malignant than in benign cases. The increased levels in association with malignancy suggested that TAT could be involved in ovarian tumor dissemination and breakage of tissue barriers. Serum samples from patients who had undergone pancreatoduodenectomy contained trypsinogen-2. Trypsinogen-1 was detected in only one of nine samples. These results suggested that the expression of trypsinogen is not restricted to the pancreas. Determination of the isoenzyme pattern by ion exchange chromatography revealed isoelectric variants of trypsinogen isoenzymes in serum samples. Intact trypsinogen isoenzymes and tryptic and chymotryptic trypsinogen peptides were purified and characterized by mass spectrometry, Western blot analysis and N-terminal sequencing. The results showed that pancreatic trypsinogen-1 and -2 are sulfated at tyrosine 154 (Tyr154), whereas TAT-2 from a colon carcinoma cell line is not. Tyr154 is located within the primary substrate binding pocket of trypsin, thus Tyr154 sulfation is likely to influence substrate binding. The previously known differences in charge, substrate specificity and inhibitor binding between pancreatic and tumor-associated trypsinogens are suggested to be caused by sulfation of Tyr154 in pancreatic trypsinogens.

Trypsiini on ihmisen tärkeimpiä valkuaisaineita pilkkovista ruoansulatusentsyymeistä. Haimanesteen pääasialliset trypsiinin esimuodot ovat trypsinogeeni-1 ja -2. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää monoklonaalisia vasta-aineita trypsinogeeni-1 ja -2:lle, sekä näihin vasta-aineisiin perustuvat herkät ja spesifiset määritysmenetelmät. Kehittämillämme vasta-aineilla ja määritysmenetelmillä olemme voineet puhdistaa, karakterisoida jä määrittää trypsinogeeni-1 ja -2:ta erilaisista biologisista näytteistä. Verrokkihenkilöiden seerumissa on korkeampi pitoisuus trypsinogeeni-1 kuin -2:ta. Akuutissa haimatulehduksessa sen sijaan trypsinogeeni-2 -pitoisuus voi olla jopa 50-kertainen verrokkeihin nähden, kun taas trypsinogeeni-1-pitoisuus oli noin 15-kertainen. Tutkimuksemme perusteella trypsinogeeni-2:ta voitaisiin käyttää akuutin haimatulehduksen diagnostisena merkkiaineena, mikä on jatkotutkimuksissa vahvistettu. Kasvaimiin liittyvä trypsinogeeni-2 (TAT-2) on ihmisen munasarjakystanesteen pääasiallinen trypsinogeenimuoto. Varsinkin musinoottisissa munasarjakystanesteissä TAT-2 pitoisuus oli suoraan verrannollinen kasvaimen pahanlaatuisuuteen. Tämä tulos viittaa siihen, että TAT voi olla osallisena munasarjasyövän leviämisessä ja ympäröivän kudoksen hajottamisessa. Kehitettyjen herkkien määritysmenetelmien avulla pystyimme määrittämään trypsinogeeni-2 -pitoisuudet haimapoistopotilaiden seeruminäytteistä. Trypsinogeeni-1:tä voitiin havaita vain yhdestä näytteestä yhdeksästä. Tämän perusteella trypsinogeenin ilmentyminen ei rajoitu haimaan, toisin kuin aiemmin oli oletettu. Nykytietämyksen mukaan trypsinogeenimuotoja ilmenee useissa normaaleissa ja pahanlaatuisissa kudoksissa. Havaitsimme seeruminäytteissä kahta eri muotoa sekä trypsinogeeni-1 että -2:ta. Trypsinogeenimuotoja ja niistä pilkottuja peptidejä tutkittiin mm. massaspektrometrisin menetelmin ja vasta-aineiden avulla. Tulosten perusteella haimaperäisten trypsinogeeni-1 ja -2-muotojen tyrosiinitähde 154 (Tyr154) sisältää sulfaattiryhmän, toisin kuin syöpäsolulinjaperäinen TAT-2. Tyr154 sijaitsee trypsiinissä kohdeproteiinin sitomiskohdassa. Näin ollen Tyr154 sulfatoituminen todennäköisesti vaikuttaa kohdeproteiinien sitoutumiseen. Saadut tulokset selittävät aiemmin havaitut erot sekä haima- ja kasvainperäisten trypsinogeenimuotojen varauksessa että kohde-proteiinien sitoutumisessa.