Mutations as molecular tools : The metabolic-rate dependent molecular clock and DNA barcoding of allied species

Mutation and recombination are the fundamental processes leading to genetic variation in natural populations. This variation forms the raw material for evolution through natural selection and drift. Therefore, studying mutation rates may reveal information about evolutionary histories as well as phylogenetic interrelationships of organisms. In this thesis two molecular tools, DNA barcoding and the molecular clock were examined. In the first part, the efficiency of mutations to delineate closely related species was tested and the implications for conservation practices were assessed. The second part investigated the proposition that a constant mutation rate exists within invertebrates, in form of a metabolic-rate dependent molecular clock, which can be applied to accurately date speciation events. DNA barcoding aspires to be an efficient technique to not only distinguish between species but also reveal population-level variation solely relying on mutations found on a short stretch of a single gene. In this thesis barcoding was applied to discriminate between Hylochares populations from Russian Karelia and new Hylochares findings from the greater Helsinki region in Finland. Although barcoding failed to delineate the two reproductively isolated groups, their distinct morphological features and differing life-history traits led to their classification as two closely related, although separate species. The lack of genetic differentiation appears to be due to a recent divergence event not yet reflected in the beetles molecular make-up. Thus, the Russian Hylochares was described as a new species. The Finnish species, previously considered as locally extinct, was recognized as endangered. Even if, due to their identical genetic make-up, the populations had been regarded as conspecific, conservation strategies based on prior knowledge from Russia would not have guaranteed the survival of the Finnish beetle. Therefore, new conservation actions based on detailed studies of the biology and life-history of the Finnish Hylochares were conducted to protect this endemic rarity in Finland. The idea behind the strict molecular clock is that mutation rates are constant over evolutionary time and may thus be used to infer species divergence dates. However, one of the most recent theories argues that a strict clock does not tick per unit of time but that it has a constant substitution rate per unit of mass-specific metabolic energy. Therefore, according to this hypothesis, molecular clocks have to be recalibrated taking body size and temperature into account. This thesis tested the temperature effect on mutation rates in equally sized invertebrates. For the first dataset (family Eucnemidae, Coleoptera) the phylogenetic interrelationships and evolutionary history of the genus Arrhipis had to be inferred before the influence of temperature on substitution rates could be studied. Further, a second, larger invertebrate dataset (family Syrphidae, Diptera) was employed. Several methodological approaches, a number of genes and multiple molecular clock models revealed that there was no consistent relationship between temperature and mutation rate for the taxa under study. Thus, the body size effect, observed in vertebrates but controversial for invertebrates, rather than temperature may be the underlying driving force behind the metabolic-rate dependent molecular clock. Therefore, the metabolic-rate dependent molecular clock does not hold for the here studied invertebrate groups. This thesis emphasizes that molecular techniques relying on mutation rates have to be applied with caution. Whereas they may work satisfactorily under certain conditions for specific taxa, they may fail for others. The molecular clock as well as DNA barcoding should incorporate all the information and data available to obtain comprehensive estimations of the existing biodiversity and its evolutionary history.

Mutaatiot ja geneettinen rekombinaatio ovat luonnonpopulaatioiden perinnöllisen muuntelun perusta. Evoluutio muovaa tätä ainesta luonnonvalinnan ja ajautumisen kautta. On ilmeistä, että mutaatiofrekvenssin tutkiminen valaisee niin evoluution kulkua kuin eliöiden sukulaisuussuhteita. Tässä väitöskirjassa tutkittiin kahta molekyylibiologien työkalua, DNA-viivakoodia ja molekyylikelloa. Työn ensimmäisessä osassa tarkasteltiin eri geenialueiden kykyä luonnehtia lähisukuisia lajeja ja tämän kysymyksen merkitystä luonnonsuojelubiologiassa. Työn toisessa osassa tutkittiin hypoteesia, jonka mukaan hyönteisten mutaatiofrekvenssi noudattaa molekyylikelloa. Kohteena oli erityisesti hypoteesi, jonka mukaan molekyylikellon tarkkuutta voi parantaa huomioimalla eri lajien lämpötila. DNA-viivakoodauksella otaksutaan voitavan erottaa lajeja toisistaan tietyn geenialueen avulla. Tutkimuksessa verrattiin Suomesta hiljattain uudelleen löydetyn kovakuoriaisen, haapasepikän ja lajin venäläisten yksilöiden geenialueita keskenään. Kaikki yksilöt osoittautuivat identtisiksi jokaisen tutkitun geenialueen suhteen. Toisaalta suomalaiset ja venälaiset yksilöt erosivat toisistaan niin elintapojensa kuin rakenteensa suhteen. Suomessa laji kehittyi kovapuisissa halavissa ja mustuvapajuissa, Venäjällä suurissa lahoavissa haavoissa. Suomalaiset yksilöt olivat myös hiukan hoikkarakenteisempia kuin venäläiset ja molempien muotojen koiraiden sukupuolielimet olivat selvästi toisistaan eroavat. Näillä perusteilla Suomesta kuvattu laji piti vanhan tieteellisen nimensä, Hylochares cruentatus (Gyllenhal), mutta suomeksi se ristittiin uudelleen halavasepikäksi. Haapasepikän nimi jätettiin maamme rajojen ulkopuolella elävälle lajille, joka kuvattiin tieteelle uutena nimellä Hylochares populi Brüstle -- Muona. Haapasepikän biologiaa ei tunnettu Suomesta, koska siitä tiedettiin vain kaksi hyvin vanhaa löytöä. Lajin katsottiin hävinneen maastamme suurten haapojen myötä, elihän se tällaisissa puissa Venäjän Karjalassa. Havainnot Suomessa osoittivat, että olettamus oli virheellinen. Kyse oli kahdesta eri lajista, joiden elintavat erosivat toisistaan selvästi. Luonnonsuojelubiologian kannalta tämä oli tärkeä havainto. DNA-viivakoodin tutkiminen ei pystynyt osoittamaan kahden lajin olemassaoloa. Aiempi päättely Karjalan havaintojen kelpoisuudesta Suomen lajin suojeluun oli myös virheellinen. Halavasepikkä on ilmeisesti hyvin hiljan eriytynyt haapasepikän sisarlaji, joka tunnetaan vain Suomesta. Kaikki vanhat havainnot Suomen ulkopuolelta koskevat haapasepikkää. Halavasepikkä on saimaannorpan kaltainen, kotoperäinen suomalainen eläin. Molekyylikellon ajatuksena on, että mutaatiot kertyvät tietylle geenialueelle vakionopeudella ja näin makromolekyylien erojen perusteella voidaan päätellä evolutiivisten haarautumien ikä. Tätä kellon hypoteesia on tarkennettu eri tavoin myöhemmin. Sen sijaan, että kello tikittää vakionopeudella, otaksutaan sen noudattavan hienovaraisempia sääntöjä. Hiljan esitetyn hypoteesin mukaan kello ei tikitä vain aikayksikköä kohden. Ajan ohella mutaatiot kertyvät suhteessa eliön lämpötilasta ja massasta riippuvaan aineenvaihduntaenergiaan. Tämän hypoteesin mukaan molekyylikello tulee kalibroida huomioiden eliön paino ja lämpötila. Tässä tutkimuksen osassa selvitettiin lämpötilan vaikutusta mutaatiofrekvenssiin tasakokoisilla lajeilla. Käytössä oli kaksi eri aineistoa. Ensimmäinen näistä oli pantrooppinen sepiköiden heimoon kuuluva a kovakuoriaissuku Arrhipis. Ennen kellohypoteesin tutkimista myös Arrhipis-lajien sukulaisuussuhteet selvitettiin. Toinen aineisto koostui kukkakärpäsistä, joiden fylogenia oli selvitetty aiemmin. Molempia aineistoja tutkittiin eri analyysimenetelmin, usean geenin suhteen ja kokeillen useaa kellohypoteesia. Tulokset osoittivat, että lämpötilalla ja mutaatiofrekvenssillä ei ollut yhteyttä tutkituilla eliöillä. Näin ollen lämmöstä riippuvaa aineenvaihduntaenergia-hypoteesin mukaista molekyylikelloa ei havaittu. Tulosten mukaan on suhtauduttava varovaisuudella kelloon perustuviin molekyylibiologisiin menetelmiin. Ne voivat toimia tietyissä tilanteissa tietyillä eliöillä, mutta pettää toisessa tilanteessa. Sovellettaessa molekyylikelloa ja DNA-viivakoodausta monimuotoisuuden ja evolutiivisen historian tutkimuksessa on syytä käyttää mahdollisimman laajasti saatavilla olevaa muuta tietoa ja välttää yksinkertaistettuja ratkaisuja.