Novel Molecular Mechanisms of Arabidopsis Disease Resistance

Plants are capable of recognizing phytopathogens through the perception of pathogen-derived molecules or plant cell-wall degradation products due to the activities of pathogen-secreted enzymes. Such elicitor recognition events trigger an array of inducible defense responses involving signal transduction networks and massive transcriptional re-programming. The outcome of a pathogen infection relies on the balance between different signaling pathways, which are integrated by regulatory proteins. This thesis characterized two key regulatory components: a damage control enzyme, chlorophyllase 1 (AtCHL1), and a transcription factor, WRKY70. Their roles in defense signaling were then investigated. The Erwinia-derived elicitors rapidly activated the expression of AtCLH1 and WRKY70 through different signaling pathways. The expression of the AtCHL1 gene was up-regulated by jasmonic acid (JA) but down-regulated by salicylic acid (SA), whereas WRKY70 was activated by SA and repressed by JA. In order to elucidate the functions of AtCLH1 and WRKY70 in plant defense, stable transgenic lines were produced where these genes were overexpressed or silenced. Additionally, independent knockout lines were also characterized. Bacterial and fungal pathogens were then used to assess the contribution of these genes to the Arabidopsis disease resistance. The transcriptional modulation of AtCLH1 by either the constitutive over-expression or RNAi silencing caused alterations in the chlorophyll-to-chlorophyllide ratio, supporting the claim that chlorophyllase 1 has a role in the chlorophyll degradation pathway. Silencing of this gene led to light-dependent over-accumulation of the reactive oxygen species (ROS) in response to infection by Erwinia carotovora subsp. carotovora SCC1. This was followed by an enhanced induction of SA-dependent defense genes and an increased resistance to this pathogen. Interestingly, little effect on the pathogen-induced SA accumulation at the early infection was observed, suggesting that action of ROS might potentiate SA signaling. In contrast, the pathogen-induced JA production was significantly reduced in the RNAi silenced plants. Moreover, JA signaling and resistance to Alternaria brassicicola were impaired. These observations provide support for the argument that the ROS generated in chloroplasts might have a negative impact on JA signaling. The over-expression of WRKY70 resulted in an enhanced resistance to E. carotovora subsp. carotovora SCC1, Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 and Erysiphe cichoracearum UCSC1, whilst an antisense suppression or an insertional inactivation of WRKY70 led to a compromised resistance to E. carotovora subsp. carotovora SCC1 and to E. cichoracearum UCSC1 but not to P. syringae pv. tomato DC3000. Gene expression analysis revealed that WRKY70 activated many known defense-related genes associated with the SAR response but suppressed a subset of the JA-responsive genes. In particular, I was able to show that both the basal and the induced expression of AtCLH1 was enhanced by the antisense silencing or the insertional inactivation of WRKY70, whereas a reduction in AtCLH1 expression was observed in the WRKY70 over-expressors following an MeJA application or an A. brassicicola infection. Moreover, the SA-induced suppression of AtCLH1 was relieved in wrky70 mutants. These results indicate that WRKY70 down-regulates AtCLH1. An epistasis analysis suggested that WRKY70 functions downstream of the NPR1 in an SA-dependent signaling pathway. When challenged with A. brassicicola, WRKY70 over-expressing plants exhibited a compromised disease resistance while wrky70 mutants had the opposite effect. These results confirmed the WRKY70-mediated inhibitory effects on JA signaling. Furthermore, the WRKY70-controlled suppression of A. brassicicola resistance was mainly through an NPR1-dependent mechanism. Taking all the data together, I suggest that the pathogen-responsive transcription factor WRKY70 is a common component in both SA- and JA-dependent pathways and plays a crucial role in the SA-mediated suppression of JA signaling.

Kasvit kykenevät tunnistamaan niitä infektoivia patogeenejä hyödyntämällä ns. elisitoreja, patogeeneistä peräisin olevia molekyylejä tai kasvien soluseinän hajoamistuotteita, joita syntyy patogeenien erittämien entsyymien toiminnan tuloksena. Tämä tunnistus johtaa useiden puolustusreittien aktivoitumiseen. Näitä puolustusreittejä säätelevät erityyppiset signaalinvälitysverkostot ja niiden seurauksena kasvin transkriptioprofiili muuttuu. Patogeeni-infektion lopputulos riippuu eri signaalinvälitysreittien välisestä tasapainosta, jota puolestaan säätelyproteiinit koordinoivat. Tässä väitöskirjatyössä karakterisoitiin kaksi keskeistä säätelykomponenttia lituruohosta (Arabidopsis thaliana): vahinkoja monitoroiva ja kontrolloiva entsyymi klorofyllaasi 1 (AtCHL1) ja transkriptiofaktori WRKY70. Lisäksi työssä tutkittiin näiden komponenttien osuutta puolustusreaktioihin liittyvässä signaloinnissa. Kasvipatogeenin Erwinia-sukuun kuuluvan bakteerin tuottamat elisitorit aktivoivat nopeasti sekä AtCHL että WRKY70 geenit ja geenien aktivointi tapahtui eri signaalinvälitysreittien kautta. AtCHL geeni aktivoitui jasmonihapon (JA) välityksellä, kun taas WRKY70 aktivoinnin välitti salisyylihappo (SA) ja aktivaatiota esti JA. Näiden geenien osuutta patogeenivasteen muodostumisessa tutkittiin tekemällä siirtogeenisiä lituruohoja, joissa AtCHL1:tä tai WRKY70:tä joko ylituotettiin tai niitä koodavat geenit vaimennettiin. Lisäksi työssä hyödynnettiin lituruohon ns. knockout linjoja, joissa geenit on vaimennettu liittämällä niiden keskelle vierasta DNA:ta. Patogeenejä bakteereja ja sieniä käytettiin selvittämään muokattujen geenien osuutta lituruohon taudinvastustuskykyyn. AtCHL1:n osalta sekä entsyymin ylituotto, että geenin vaimennus RNAi-tekniikalla johti klorofylli-klorofyllidi suhteen muuttumiseen osoittaen, että AtCHL1 osallistuu klorofyllin hajotukseen kasvin soluissa. Geenin vaimentaminen johti valosta riippuvaiseen happiradikaalien muodostumiseen Erwinia-infektion seurauksena. Lisäksi infektio johti SA reitin säätelemien geenien voimakkaampaan aktivaatioon ja kasvaneeseen resistenssiin villityypin kasveihin verrattuna, mikä viittaa siihen, että syntyneillä happiradikaaleilla on kyky vahvistaa SA-välitteistä vastetta. Toisaalta, infektion aiheuttama JA tuotanto oli näissä kasveissa merkittävästi alhaisempi. Lisäksi JA välitteinen signalointi ei toiminut normaalisti, mikä myös heijastui alhaisempana resistenssitasona Alternaria brassicicolalle, jota vastaan resistenssi pääsääntöisesti muodostuu JA-välitteisen reitin kautta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että viherhiukkasissa tuotetuilla happiradikaaleilla on negatiivinen vaikutus JA-välitteiseen signalointiin. WRKY70:n ylituotto johti kasvaneeseen resistenssiin Erwiniaa, Pseudomonas syringaeta ja Eryshipe cichoracearumia vastaan ja geenin vaimennus antisense-tekniikalla tai vieraan DNA:n insertiolla johti alentuneeseen resistenssiin Erwiniaa, ja Eryshipe cichoracearumia vastaan. Geenitoiminnan analyysi DNA sirujen avulla osoitti, että WRKY70 aktivoi useita tunnettuja puolustusgeenejä, jotka liittyvät resistenssin muodostukseen, mutta se myös vaimensi osan JA-aktivoiduista geeneistä (mm. AtCHL1). Epistaasianalyysi osoitti, että WRKY70 toimii NPR:n alapuolella SA-välitteisessä signalointireitissä. (NPR on eräs SA-reitin keskeisistä säätelijöistä). WRKY70:tä ylituottavilla kasveilla oli alentunut resistenssi A. brassicicolalle kun taas WRKY70:tä tuottamattomilla kasveilla resistenssitaso oli kohonnut, mikä osoittaa WRKY70:n vaikuttavan negatiivisesti JA-välitteiseen vasteeseen. Yhteenvetona esitän, että patogeeni-indusoitu WRKY70 toimii sekä SA- että JA-välitteisissä signaalinvälitysreiteissä ja sillä on keskeinen osuus SA-välitteisessä JA-reitin vaimennuksessa.