Positional cloning and pathway analysis of the asthma susceptibility gene, NPSR1

In the present study, we identified a novel asthma susceptibility gene, NPSR1 (neuropeptide S receptor 1) on chromosome 7p14.3 by the positional cloning strategy. An earlier significant linkage mapping result among Finnish Kainuu asthma families was confirmed in two independent cohorts: in asthma families from Quebec, Canada and in allergy families from North Karelia, Finland. The linkage region was narrowed down to a 133-kb segment by a hierarchial genotyping method. The observed 77-kb haplotype block showed 7 haplotypes and a similar risk and nonrisk pattern in all three populations studied. All seven haplotypes occur in all three populations at frequences > 2%. Significant elevated relative risks were detected for elevated total IgE (immunoglobulin E) or asthma. Risk effects of the gene variants varied from 1.4 to 2.5. NPSR1 belongs to the G protein-coupled receptor (GPCR) family with a topology of seven transmembrane domains. NPSR1 has 9 exons, with the two main transcripts, A and B, encoding proteins of 371 and 377 amino acids, respectively. We detected a low but ubiquitous expression level of NPSR1-B in various tissues and endogenous cell lines while NPSR1-A has a more restricted expression pattern. Both isoforms were expressed in the lung epithelium. We observed aberrant expression levels of NPSR1-B in smooth muscle in asthmatic bronchi as compared to healthy. In an experimental mouse model, the induced lung inflammation resulted in elevated Npsr1 levels. Furthermore, we demonstrated that the activation of NPSR1 with its endogenous agonist, neuropeptide S (NPS), resulted in a significant inhibition of the growth of NPSR1-A overexpressing stable cell lines (NPSR1-A cells). To determine which target genes were regulated by the NPS-NPSR1 pathway, NPSR1-A cells were stimulated with NPS, and differentially expressed genes were identified using the Affymetrix HGU133Plus2 GeneChip. A total of 104 genes were found significantly up-regulated and 42 down-regulated 6 h after NPS administration. The up-regulated genes included many neuronal genes and some putative susceptibility genes for respiratory disorders. By Gene Ontology enrichment analysis, the biological process terms, cell proliferation, morphogenesis and immune response were among the most altered. The expression of four up-regulated genes, matrix metallopeptidase 10 (MMP10), INHBA (activin A), interleukin 8 (IL8) and EPH receptor A2 (EPHA2), were verified and confirmed by quantitative reverse-transcriptase-PCR. In conclusion, we identified a novel asthma susceptibility gene, NPSR1, on chromosome 7p14.3. NPS-NPSR1 represents a novel pathway that regulates cell proliferation and immune responses, and thus may have functional relevance in the pathogenesis of asthma.

Astma on keuhkoputkien limakalvojen tulehdussairaus, joka aiheuttaa keuhkojen toiminnan häiriöitä ja erityisesti keuhkoputkien ahtautumista. Astma on monitekijäinen sairaus, jonka syntyyn vaikuttavat useiden eri periytyvien alttiusgeenien ja ympäristötekijöiden vuorovaikutus. Suomessa arviolta 6% väestöstä sairastaa astmaa. Astma on yleisin lääkitystä vaativa pitkäaikaissairaus lapsilla. Tutkimuksessamme löysimme uuden astmalle altistavan geenin, NPSR1:n (neuropeptidi S reseptori 1). Löydöksemme pohjautuu aiempaan tutkimukseeme, koko genomin kattavaan geenihakuun (kytkentäanalyysi), jossa paikansimme kainuulais-potilailta astmalle altistavan alueen kromosomista 7. Tässä väitöstutkimuksessa osoitimme NPSR1:n riskivaikutuksen myös kahdessa muussa potilasaineistossa: pohjoiskarjalaisilla ja kanadan-ranskalaisilla perheillä. Osoitimme, että riski sairastua astmaan on 1.4-2.5 kertainen geenin riskimuotoa kantavilla potilailla verrrattuna muuhun väestöön. NPSR1-proteiini kuuluu rakenteensa perusteella G-proteiinireseptoreihin, jotka toimivat solukalvolla välittäen signaaleja solun sisäpuolelle. Tutkimme NPSR1:n ilmentymistä ja osoitimme, että NPSR1 ilmenee useissa erityyppisissä soluissa ja kudoksissa, kuten keuhkojen ja ruoansulatuskanavan limakalvoilla sekä iholla. Osoitimme kudosvärjäyksin, että astmaa sairastavilla potilailla NPSR1:n määrä keuhkojen sileässä lihaksessa kasvoi terveisiin verrokkeihin verrattuna. Lisäksi osoitimme hiirimallilla, että aiheutettu astman kaltainen keuhkotulehdus johti NPSR1:n märän kasvuun hiiren keuhkoissa. NPSR1:n toiminnasta saimme solumallia käyttäen selville, että NPSRI säätelee solukasvua. Edelleen tutkimme mikrosirutekniikalla, mitkä ovat NPSR1:n kohdegeenejä. Stimuloimme NPSR1:tä ylituottavat solut spesifisellä neuropeptidi S ligandilla (NPS) ja määritimme kohdegeenien ilmentymisen 6 tuntia stimulaation jälkeen. Tunnistimme 104 geeniä, joiden ilmentyminen oli kasvanut, sekä 42 geeniä, joiden ilmentyminen oli laskenut. NPSR1:n säätelemien geenien joukossa oli mm. muutamia neuronaalisia geenejä sekä hengitystiesairauksien mahdollisia alttiusgeenejä. Analysoimme mitä toimintoja kohdegeenit säätelevät, ja tärkeimmät ryhmät olivat immuunivasteet, morfologia ja proliferaatio (solukasvun säätely). Yhteenvetona todettakoon, että tässä tutkimuksessa löysimme uuden astmalle altistavan geenin, NPSR1:n, jonka proteiinituote kuuluu G-proteiinireseptoreihin. Tämäntyyppiset solukalvon reseptorit ovat yleisiä lääkekohdemolekyylejä, ja siten myös NPSR1:lle on teoriassa mahdollista kehittää lääkeaine, kunhan NPS-NPSR1 -signaalireitin vaikutukset astman syntyyn tunnetaan paremmin.