Transcriptome and proteome analysis of xylose-metabolising Saccharomyces cerevisiae

Increasing concern about global climate warming has accelerated research into renewable energy sources that could replace fossil petroleum-based fuels and materials. Bioethanol production from cellulosic biomass by fermentation with baker s yeast Saccharomyces cerevisiae is one of the most studied areas in this field. The focus has been on metabolic engineering of S. cerevisiae for utilisation of the pentose sugars, in particular D-xylose that is abundant in the hemicellulose fraction of biomass. Introduction of a heterologous xylose-utilisation pathway into S. cerevisiae enables xylose fermentation, but ethanol yield and productivity do not reach the theoretical level. In the present study, transcription, proteome and metabolic flux analyses of recombinant xylose-utilising S. cerevisiae expressing the genes encoding xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH) from Pichia stipitis and the endogenous xylulokinase were carried out to characterise the global cellular responses to metabolism of xylose. The aim of these studies was to find novel ways to engineer cells for improved xylose fermentation. The analyses were carried out from cells grown on xylose and glucose both in batch and chemostat cultures. A particularly interesting observation was that several proteins had post-translationally modified forms with different abundance in cells grown on xylose and glucose. Hexokinase 2, glucokinase and both enolase isoenzymes 1 and 2 were phosphorylated differently on the two different carbon sources studied. This suggests that phosphorylation of glycolytic enzymes may be a yet poorly understood means to modulate their activity or function. The results also showed that metabolism of xylose affected the gene expression and abundance of proteins in pathways leading to acetyl-CoA synthesis and altered the metabolic fluxes in these pathways. Additionally, the analyses showed increased expression and abundance of several other genes and proteins involved in cellular redox reactions (e.g. aldo-ketoreductase Gcy1p and 6-phosphogluconate dehydrogenase) in cells grown on xylose. Metabolic flux analysis indicated increased NADPH-generating flux through the oxidative part of the pentose phosphate pathway in cells grown on xylose. The most importantly, results indicated that xylose was not able to repress to the same extent as glucose the genes of the tricarboxylic acid and glyoxylate cycles, gluconeogenesis and some other genes involved in the metabolism of respiratory carbon sources. This suggests that xylose is not recognised as a fully fermentative carbon source by the recombinant S. cerevisiae that may be one of the major reasons for the suboptimal fermentation of xylose. The regulatory network for carbon source recognition and catabolite repression is complex and its functions are only partly known. Consequently, multiple genetic modifications and also random approaches would probably be required if these pathways were to be modified for further improvement of xylose fermentation by recombinant S. cerevisiae strains.

Ilmaston lämpeneminen ja fossiilisten polttoaineiden rajallisuus on lisännyt kiinnostusta uusiutuvista raaka-aineista valmistettaviin polttoaineisiin ja tuotteisiin. Polttoaine-etanoli, joka on tuotettu fermentoimalla kasviperäistä selluloosaa ja hemiselluloosaa sisältävää kasvimateriaalia, on paljon tutkittu vaihtoehto fossiilisille polttoaineille. Kaikkien kasvimateriaalissa olevien sokereiden hyödyntäminen on tärkeää etanolin tuotannon taloudelliselle kannattavuudelle. Laajalti etanolin tuottoon käytettävä leivinhiiva S. cerevisiae fermentoi kuitenkin tehokkaasti vain glukoosia ja heksoosisokereita eikä kykene käyttämään hemiselluloosassa suhteellisen runsaana esiintyvää viisihiilistä pentoosisokeria ksyloosia. Ksyloosin käytön mahdollistavat entsyymit ksyloosireduktaasi ja ksylitolidehydrogenaasi, joita ilmentävät geenit on siirretty leivinhiivaan Pichia stipitis -hiivasta. Ksyloosia käyttävät muuntogeeniset leivinhiivakannat tuottavat ksyloosista etanolia, mutta etanolin saanto ja tuottonopeus eivät vielä yllä toivotulle tasolle. Tässä työssä on etsitty uusia keinoja parantaa leivinhiivan ksyloosin fermentointikykyä vertaamalla ksyloosia käyttävän leivinhiivan ksyloosiaineenvaihduntaa glukoosiaineenvaihduntaan DNA-sirujen, proteomiikan ja aineenvaihduntavuoiden mallintamisen avulla. Tulokset osoittavat, että ksyloosi ei kykene glukoosin tavoin vaimentamaan leivinhiivassa sitruunahappokierron, glyoksylaattisyklin ja glukoneogeneesin proteiineja ilmentäviä geenejä eikä useita muita geenejä, jotka liittyvät muiden hiilen lähteiden kuin sokereiden käyttöön. Ksyloosin käyttö muutti myös asetyyli-CoA:n valmistukseen liittyvien geenien ilmentymistä sekä asetyyli-CoA:n aineenvaihduntareitillä olevien proteiinien määriä. Lisäksi ksyloosin käyttö aktivoi geenejä, joiden ilmentyminen on aiemmin liitetty hiilen lähteen ja ravinteiden loppumiseen. Mielenkiintoinen havainto oli, että glykolyysiin osallistuvat entsyymit heksokinaasi, glukokinaasi ja enolaasi fosforyloituivat eri tavoin ksyloosilla ja glukoosilla kasvaneissa soluissa, mikä viittaa siihen, että näiden entsyymien aktiivisuutta ja/tai toimintaa eri olosuhteissa säädellään fosforylaation avulla. Tutkimuksessa havaittiin myös, että ksyloosilla kasvaneissa soluissa useiden solujen hapetus- ja pelkistysreaktioihin osallistuvien proteiinien määrä ja niitä ilmentävien geenien transkriptio oli lisääntynyt. Lisäksi aineenvaihduntavuoiden mallinnus osoitti, että hiilivirta pentoosifosfaattireitin sen osan kautta, joka tuottaa NADPH:ta, oli vilkastunut ksyloosia käyttävissä soluissa verrattuna glukoosilla kasvaneisiin soluihin. Nämä tulokset viittaavat muuntogeenisen hiivan pyrkimykseen lisätä solun sisäisen NADPH:n määrää ksyloosireduktaasientsyymin tarpeisiin. Kaiken kaikkiaan soluissa havaitut muutokset viittaavat siihen, että S. cerevisiae ei kykene tunnistamaan ksyloosia glukoosin kaltaiseksi täysin fermentoitavaksi hiilen lähteeksi. Tämä on luultavasti yksi syistä miksi etanolin saanto ja ksyloosin fermentointinopeus eivät yllä optimaaliselle tasolle. Hiilen käyttöön liittyvän aineenvaihduntaverkon toiminnan säätely on mutkikasta ja vain osittain tunnettua. Onkin todennäköistä, että etanolin tuotannon tehostamiseksi ksyloosista säätelyverkkoa muuttamalla tarvitaan useiden säätelyyn osallistuvien geenien ilmentymisen muuttamista tai geenien sattumanvaraista mutageneesiä.