Nuclear Import Mechanisms of STAT and NF-kB Transcription Factors

The eukaryotic cell nucleoplasm is separated from the cytoplasm by the nuclear envelope. This compartmentation of eukaryotic cells requires that all nuclear proteins must be transported from the cytoplasm into the nucleus. Transport of macromolecules between the nucleus and the cytoplasm occurs through nuclear pore complexes (NPCs). Proteins to be targeted into the nucleus by the classical nuclear import system contain nuclear localization signals (NLSs), which are recognized by importin alpha, the NLS receptor. Importin alpha binds to importin beta, which docks the importin-cargo complex on the cytoplasmic side of the NPC and mediates the movement of the complex into the nucleus. Presently six human importin alpha isoforms have been identified. Transcription factors are among the most important regulators of gene expression in eukaryotic organisms. Transcription factors bind to specific DNA sequences on target genes and modulate the activity of the target gene. Many transcription factors, including signal transducers and activators of transcription (STAT) and nuclear factor kB (NF-kB), reside in the cytoplasm in an inactive form, and upon activation they are rapidly transported into the nucleus. In the nucleus STATs and NF-kB regulate the activity of genes whose products are critical in controlling numerous cellular and organismal processes, such as inflammatory and immune responses, cell growth, differentiation and survival. The aim of this study was to investigate the nuclear import mechanisms of STAT and NF-kB transcription factors. This work shows that STAT1 homodimers and STAT1/STAT2 heterodimers bind specifically and directly to importin alpha5 molecule via unconventional dimer-specific NLSs. Importin alpha molecules have two regions, which have been shown to directly interact with the amino acids in the NLS of the cargo molecule. The Arm repeats 2-4 comprise the N-terminal NLS binding site and Arm repeats 7-8 the C-terminal NLS binding site. In this work it is shown that the binding site for STAT1 homodimers and STAT1/STAT2 heterodimers is composed of Arm repeats 8 and 9 of importin alpha5 molecule. This work demonstrates that all NF-kB proteins are transported into the nucleus by importin alpha molecules. In addition, NLS was identified in RelB protein. The interactions between NF-kB proteins and importin alpha molecules were found to be directly mediated by the NLSs of NF-kB proteins. Moreover, we found that p50 binds to the N-terminal and p65 to the C-terminal NLS binding site of importin alpha3. The results from this thesis work identify previously uncharacterized mechanisms in nuclear import of STAT and NF-kB. These findings provide new insights into the molecular mechanisms regulating the signalling cascades of these important transcription factors from the cytoplasm into the nucleus to the target genes.

Tumakalvo erottaa eukaryoottisolun nukleoplasman sytoplasmasta. Tämän vuoksi kaikki sytoplasmassa tuotetut tumaproteiinit kuljetetaan tumakalvolla sijaitsevien tumahuokosten kautta sytoplasmasta tumaan. Tumalokalisaatiosignaalit (nuclear localization signals; NLSs) välittävät tumaan kuljetettavien proteiinien tunnistusta. NLS-signaalin tunnistaa alfa-importiini, NLS-reseptori, joka puolestaan sitoutuu beta-importiiniin. Beta-importiini on kuljetusproteiini, joka välittää tumaan kuljetettavan proteiinin ja alfa-importiinin muodostaman kompleksin sitoutumisen tumahuokoseen ja siirtymisen tumaan. Ihmisellä alfa-importiini-molekyylejä on tunnistettu kuusi erilaista alatyyppiä. Transkriptiotekijät ovat tärkeimpiä geenien ilmentymiseen vaikuttavia molekyylejä. Transkriptiotekijät sitoutuvat tarkoin määrättyihin säätelyjaksoihin DNA-molekyylissä ja vaikuttavat geenien ilmentymiseen. Useat transkriptiotekijät, kuten sytokiinien indusoimat signal transducers and activators of transcription (STAT) ja nuclear factor kB (NF-kB), esiintyvät sytoplasmassa inaktiivisina ja aktivoiduttuaan kulkeutuvat nopeasti tumaan saaden aikaan muutoksia geenien ilmentymisessä. STAT- ja NF-kB-transkriptiotekijät ovat hyvin tärkeitä geenien toiminnan säätelijöitä mm. elimistön puolustusjärjestelmässä viruksia ja mikrobeja vastaan, solujen kehittymisessä ja erilaistumisessa sekä solukuoleman säätelyssä. Tässä työssä selvitimme STAT- ja NF-kB-transkriptiotekijöiden tumakuljetusta. Osoitimme STAT1-homodimeerien ja STAT1/STAT2-heterodimeerien sitoutuvan suoraan alfa5-importiiniin epätavallisten, rakenteellisten NLS-signaalien välityksellä. Alfa-importiinissa on kaksi aluetta, joiden on aiemmin osoitettu suoraan sitoutuvan tumaan kuljetettavien proteiinien NLS-signaalien aminohappoihin. Nämä alueet koostuvat alfa-importiinin N-terminaalisista Arm 2-4 -toistojaksoista, sekä C-terminaalisista Arm 7-8 -toistojaksoista. Selvitimme STAT1-homodimeerien ja STAT1/STAT2-heterodimeerien sitoutuvan alfa5-importiinin Arm 8 ja 9 -toistojaksoihin. Tutkimuksemme osoitti kaikkien NF-kB-proteiinien sitoutuvan suoraan alfa-importiineihin NF-kB-proteiineissa olevien NLS-signaalien välityksellä. Mutaatioanalyysi osoitti p50-proteiinin sitoutuvan alfa3-importiinin N-terminaaliseen Arm 3 -toistojaksoon ja p65-proteiinin C-terminaalisiin Arm 7 - ja Arm 8 -toistojaksoihin. Lisäksi tunnistimme RelB-proteiinista NLS-signaalin. Tässä väitöskirjatyössä identifioimme aiemmin tuntemattomia STAT- ja NF-kB-transkriptiotekijöiden tumakuljetustapahtumia. Tämä väitöskirjatyö syventää tietämystä molekylaarisista mekanismeista signaalinvälitysreiteissä, jotka välittävät STAT- ja NF-kB-transkriptiotekijöiden siirtymistä sytoplasmasta tumaan kohdegeenien säätelyalueille.