Substrate Selectivity and Molecular Adaptation in the Outer Membrane Proteases of Yersinia pestis and Salmonella enterica

Proteolysis is important in bacterial pathogenesis and colonization of animal and plant hosts. In this work I have investigated the functions of the bacterial outer membrane proteases, omptins, of Yersinia pestis and Salmonella enterica. Y. pestis is a zoonotic pathogen that causes plague and has evolved from gastroenteritis-causing Yersinia pseudotuberculosis about 13 000 years ago. S. enterica causes gastroenteritis and typhoid fever in humans. Omptins are transmembrane β-barrels with ten antiparallel β-strands and five surface-exposed loops. The loops are important in substrate recognition, and variation in the loop sequences leads to different substrate selectivities between omptins, which makes omptins an ideal platform to investigate functional adaptation and to alter their polypeptide substrate preferences. The omptins Pla of Y. pestis and PgtE of S. enterica are 75% identical in their amino acid sequences. Pla is a multifunctional protein with proteolytic and non-proteolytic functions, and it increases bacterial penetration and proliferation in the host. Functions of PgtE increase migration of S. enterica in vivo and bacterial survival in mouse macrophages, thus enhancing bacterial spread within the host. Mammalian plasminogen/fibrinolytic system maintains the balance between coagulation and fibrinolysis and participates in several cellular processes, e.g., cell migration and degradation of extracellular matrix proteins. This system consists of activation cascades, which are strictly controlled by several regulators, such as plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1), α2-antiplasmin (α2AP), and thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI). This work reveals novel interactions of the omptins of Y. pestis and S. enterica with the regulators of the plasminogen/fibrinolytic system: Pla and PgtE inactivate PAI-1 by cleavage at the reactive site peptide bond, and degrade TAFI, preventing its activation to TAFIa. Structure-function relationship studies with Pla showed that threonine 259 of Pla is crucial in plasminogen activation, as it prevents degradation of the plasmin catalytic domain by the omptin and thus maintains plasmin stability. In this work I constructed chimeric proteins between Pla and Epo of Erwinia pyrifoliae that share 78% sequence identity to find out which amino acids and regions in Pla are important for its functions. Epo is neither a plasminogen activator nor an invasin, but it degrades α2AP and PAI-1. Cumulative substitutions towards Pla sequence turned Epo into a Pla-like protein. In addition to threonine 259, loops 3 and 5 are critical in plasminogen activation by Pla. Turning Epo into an invasin required substitution of 31 residues located at the extracellular side of the Epo protein above the lipid bilayer, and also of the β1-strand in the N-terminal transmembrane region of the protein. These studies give an example of how omptins adapt to novel functions that advantage their host bacteria in different ecological niches.

Väitöskirjassani olen tutkinut ruttobakteerin (Yersinia pestis) ja vatsa- ja lavantautia aiheuttavan bakteerin (Salmonella enterica) pinnalla sijaitsevien proteaasien, eli muita proteiineja hajottavien proteiinien, vaikutusta ihmisen veren hyytymisjärjestelmän toimintaan sekä proteaasien rakenteen ja toiminnan välistä suhdetta. Olen tutkinut omptiineiksi kutsuttuja proteaaseja, jotka hajottavat nisäkkäiden proteiineja ja välittävät bakteerien tarttumista kudoksiin ja soluihin ollen siten bakteereille oleellisia taudin aiheuttamisessa. Omptiinit ovat tynnyrinmuotoisia, bakteerin ulkokalvon läpäiseviä proteiineja, joilla on viisi bakteerisolun ulkopinnalle ulottuvaa silmukkarakennetta. Silmukat ovat tärkeitä omptiinien tunnistaessa kohdeproteiinejaan, ja aminohappojärjestyksen eroavuudet silmukoissa saavat aikaan vaihtelun eri omptiinien kyvyssä tunnistaa kohdeproteiinejaan. Y. pestis -bakteerin omptiini Pla ja S. enterica -bakteerin PgtE ovat hyvin samanlaisia aminohappojärjestykseltään, mutta siitä huolimatta niiden toiminnassa ja kohdeproteiineissa on olennaisia eroja. Lopputulos on kuitenkin samanlainen: Pla ja PgtE auttavat bakteereja leviämään ja lisääntymään ihmiselimistössä. Veren hyytymisjärjestelmä ylläpitää tasapainoa hyytymisen ja verenvuodon välillä ja osallistuu lisäksi useisiin muihin ihmiselimistön toimintoihin. Järjestelmä koostuu useista proteiineista, joita elimistö normaalisti säätelee tarkasti aktivoimalla tai hiljentämällä niiden toimintaa. Työssäni olen tutkinut Pla:n ja PgtE:n vuorovaikutusta hyytymisjärjestelmään kuuluvien säätelyproteiinien (PAI-1 ja TAFI) kanssa. Tulokset osoittivat, että Pla ja PgtE hajottavat näitä säätelyproteiineja. Tämä johtaa säätelyproteiinien toiminnan estymiseen, jolloin hyytymien muodostus vähenee, mikä edesauttaa bakteerien leviämistä ja tunkeutumista syvemmälle elimistössä. Tutkimuksessani havaitsin myös, että kaksi Pla:n silmukkaa sekä aminohappo Thr259 ovat oleellisia Pla:n toiminnalle sen yhden kohdeproteiinin, plasminogeenin, aktivoimiseksi. Plasminogeeni kuuluu veren hyytymisjärjestelmään ja on vastuussa verihyytymien hajottamisesta. Pla välittää myös ruttobakteerien tunkeutumista ihmissoluihin. Tälle toiminnolle osoittautuivat tärkeiksi sekä Pla:n silmukoiden aminohapot että bakteerin ulkokalvon sisällä olevat osat Pla:sta. Vaikka mekanismi ihmissoluihin tunkeutumisessa on epäselvä, tulokseni osoittavat, että proteiinien hajottamiseen ja invaasiokykyyn vaikuttavat eri rakenteet Pla:ssa. Työni osoittaa, että taudinaiheuttajabakteerien vaikutukset ihmisen veren hyytymisjärjestelmään ovat laajempia kuin aiemmin tiedettiin, ja että omptiinit ovat evoluution myötä sopeutuneet erilaisiin toimintoihin ja siten edesauttavat isäntäbakteeriensa selviytymistä ja lisääntymistä. Omptiiniperhe voi myös tarjota oivallisen lähtökohdan bioteknologisille sovelluksille, joissa on tavoitteena kehittää uusia proteaaseja.