Microbial diversity in the municipal composting process and development of detection methods

Composting refers to aerobic degradation of organic material and is one of the main waste treatment methods used in Finland for treating separated organic waste. The composting process allows converting organic waste to a humus-like end product which can be used to increase the organic matter in agricultural soils, in gardening, or in landscaping. Microbes play a key role as degraders during the composting-process, and the microbiology of composting has been studied for decades, but there are still open questions regarding the microbiota in industrial composting processes. It is known that with the traditional, culturing-based methods only a small fraction, below 1%, of the species in a sample is normally detected. In recent years an immense diversity of bacteria, fungi and archaea has been found to occupy many different environments. Therefore the methods of characterising microbes constantly need to be developed further. In this thesis the presence of fungi and bacteria in full-scale and pilot-scale composting processes was characterised with cloning and sequencing. Several clone libraries were constructed and altogether nearly 6000 clones were sequenced. The microbial communities detected in this study were found to differ from the compost microbes observed in previous research with cultivation based methods or with molecular methods from processes of smaller scale, although there were similarities as well. The bacterial diversity was high. Based on the non-parametric coverage estimations, the number of bacterial operational taxonomic units (OTU) in certain stages of composting was over 500. Sequences similar to Lactobacillus and Acetobacteria were frequently detected in the early stages of drum composting. In tunnel stages of composting the bacterial community comprised of Bacillus, Thermoactinomyces, Actinobacteria and Lactobacillus. The fungal diversity was found to be high and phylotypes similar to yeasts were abundantly found in the full-scale drum and tunnel processes. In addition to phylotypes similar to Candida, Pichia and Geotrichum moulds from genus Thermomyces and Penicillium were observed in tunnel stages of composting. Zygomycetes were detected in the pilot-scale composting processes and in the compost piles. In some of the samples there were a few abundant phylotypes present in the clone libraries that masked the rare ones. The rare phylotypes were of interest and a method for collecting them from clone libraries for sequencing was developed. With negative selection of the abundant phylotyps the rare ones were picked from the clone libraries. Thus 41% of the clones in the studied clone libraries were sequenced. Since microbes play a central role in composting and in many other biotechnological processes, rapid methods for characterization of microbial diversity would be of value, both scientifically and commercially. Current methods, however, lack sensitivity and specificity and are therefore under development. Microarrays have been used in microbial ecology for a decade to study the presence or absence of certain microbes of interest in a multiplex manner. The sequence database collected in this thesis was used as basis for probe design and microarray development. The enzyme assisted detection method, ligation-detection-reaction (LDR) based microarray, was adapted for species-level detection of microbes characteristic of each stage of the composting process. With the use of a specially designed control probe it was established that a species specific probe can detect target DNA representing as little as 0.04% of total DNA in a sample. The developed microarray can be used to monitor composting processes or the hygienisation of the compost end product. A large compost microbe sequence dataset was collected and analysed in this thesis. The results provide valuable information on microbial community composition during industrial scale composting processes. The microarray method was developed based on the sequence database collected in this study. The method can be utilised in following the fate of interesting microbes during composting process in an extremely sensitive and specific manner. The platform for the microarray is universal and the method can easily be adapted for studying microbes from environments other than compost.

Kompostoinnilla tarkoitetaan biologisesti hajoavan orgaanisen jätteen hajotusta ja se on yksi tärkeimmistä biojätteen käsittelytavoista Suomessa. Mullan kaltaista lopputuotetta voidaan käyttää lannoitteena maataloudessa ja puutarhanhoidossa sekä materiaalina viherrakentamisessa ja maisemoinnissa. Täten jätteenkäsittelymenetelmän ohella kompostointi on myös kierrätysmenetelmä. Kompostointiprosessissa mikrobit ovat tärkeässä roolissa orgaanisen aineen hajottajina. Vaikka kompostoinnin mikrobiologiaa onkin tutkittu jo vuosikymmeniä, mikrobisto teollisessa suuren mittakaavan kompostointilaitoksessa on suurelta osin tuntematon. Tässä väitöskirjatyössä selvitettiin sienten ja bakteerien esiintymistä teollisessa kompostointilaitoksessa ja pienemmässä tutkimuskäyttöön rakennetussa kompostointirummussa molekyylibiologisin menetelmin. Aiemmin on havaittu, että maljakasvatuksiin perustuvilla menetelmillä saadaan selville vain noin 1 % näytteen mikrobiyhteisöstä. Yli 6000 mikrobien tunnistusalueiden DNA-fragmenttia sekvensoitiin ja tuloksena oli yli 500 erilaista bakteerien tunnistussekvenssiä ja 127 erilaista sienten sekvenssiä. Näitä sekvenssejä verrattiin kansainvälisiin sekvenssitietokantoihin. Sekä bakteerien että sienten havaittiin eroavan aiemmissa tutkimuksissa löydetyistä mikrobeista, vaikka yhteneväisyyksiäkin löytyi. Myös aiemmin tunnistamattomia mikrobisekvenssejä oli runsaasti. Tutkimuksessa havaittiin, että mikrobiyhteisöt teollisen- ja tutkimusmittakaavan laitoksella erosivat selvästi. Kloonikirjastoissa on usein monta kappaletta samaa sekvenssiä. Väitöskirjatyössä kehitettiin menetelmä, jolla runsaslukuiset sekvenssit merkitään ennen sekvensointia ja vain harvalukuiset sekvensoidaan. Tällöin tietyt yleiset sekvenssityypit eivät estä harvalukuisempien sekvenssityyppien havainnointia. Menetelmän avulla havaittiin, että 41 % kloonikirjastojen klooneista oli harvinaisia ja vain ne sekvensoitiin. Säästö sekvensoinnissa ja käsiteltävän datan määrässä oli täten huomattava. Kompostin mikrobien esiintymisessä havaittiin eroja prosessin eri vaiheiden välillä. Koska kaikkien mikrobien kloonaaminen ja sekvensointi on aikaa vievää ja kiinnostuksen kohteena on usein vain muutama sekvenssityyppi, kehitettiin näiden sekvenssien havainnointia varten mikrosirudiagnostiikkaan perustuva menetelmä. Mikrosiruja on käytetty lajiston selvittämiseen jo vuosikymmeniä, mutta käytetyt menetelmät ovat olleet puutteellisia herkkyydeltään ja tarkkuudeltaan. Väitöskirjassa kehitetyn mikrosirumenetelmän avulla saavutettiin tarkkuus, jolla kaksi lähisukuista mikrobilajia voitiin erottaa toisistaan. Menetelmä perustuu kahden DNA-koettimen liittämiseen ja työssä suunnitellun kontrollikoettimen käyttöön. Menetelmä osoittautui hyvin herkäksi ja myös pieninä määrinä esiintyvät mikrobit voitiin havainnoida. Mikrosirua voidaan siksi hyödyntää kompostointiprosessin seuraamisessa tai kompostin lopputuotteen hygieenisyyden varmentamisessa. Tämän väitöskirjatyön tulokset tuovat tärkeää tietoa teollisen kompostointiprosessin mikrobiyhteisöstä. Suunniteltua mikrosirumenetelmää voidaan soveltaa myös muiden ympäristöjen mikrobien tutkimiseen.