FGFR1 regulated gene-expression, cell proliferation and differentiation in the developing midbrain and hindbrain

The neuroectodermal tissue close to the midbrain hindbrain boundary (MHB) is an important secondary organizer in the developing neural tube. This so-called isthmic organizer (IsO) regulates cellular survival, patterning and proliferation in the midbrain (Mb) and rhombomere 1 (R1) of the hindbrain. Signaling molecules of the IsO, such as fibroblast growth factor 8 (FGF8) and WNT1 are expressed in distinct bands of cells around the MHB. It has been previously shown that FGF-receptor 1 (FGFR1) is required for the normal development of this brain region in the mouse embryo. In the present study, we have compared the gene expression profiles of wild-type and Fgfr1 mutant embryos. We show that the loss of Fgfr1 results in the downregulation of several genes expressed close to the MHB and in the disappearance of gene expression gradients in the midbrain and R1. Our microarray screen identified several previously uncharacterized genes which may participate in the development of midbrain R1 region. Our results also show altered neurogenesis in the midbrain and R1 of the Fgfr1 mutants. Interestingly, the neuronal progenitors in midbrain and R1 show different responses to the loss of signaling through FGFR1. As Wnt1 expression at the MHB region requires the FGF signaling pathway, WNT target genes, including Drapc1, were also identified in our screen. The microarray data analysis also suggested that the cells next to the midbrain hindbrain boundary express distinct cell cycle regulators. We showed that the cells close to the border appeared to have unique features. These cells proliferate less rapidly than the surrounding cells. Unlike the cells further away from the boundary, these cells express Fgfr1 but not the other FGF receptors. The slowly proliferating boundary cells are necessary for development of the characteristic isthmic constriction. They may also contribute to compartmentalization of this brain region.

Aivojen varhaiskehitystä ohjaavat ns. sekundääriset organisaattorit, joista yksi sijaitsee keski- ja taka-aivojen välisellä alueella. Tämän organisaattorin (ns. isthmic organizer, IsO) syntyyn ja sijaintiin vaikuttavat transkriptiotekijät Otx2 ja Gbx2, joita vaaditaan IsO:n oikeaan lokalisaatioon keski- ja taka-aivojen väliselle rajapinnalle. Tärkeä aivojen kehitystä ohjaava mekanismi on solujen välinen kommunikaatio. Keskeisiä kommunikaation välittäjiä ovat signaalit, joita solut valmistavat ja joita ne lähettävät ympäristöönsä. Tärkeitä IsO:n syntyyn ja toimintaan vaikuttavia signaalimolekyylejä ovat fibroblastikasvutekijät (mm. FGF8) ja WNT1. FGF8:n soluvaikutukset välittyvät solun pinnalla olevien FGF-reseptorien (FGFR1-4) kautta. Viesti siirtyy monivaiheisen viestiverkoston kautta lopulta tumaan ja säätelee siellä geenien toimintaa ja sitä kautta solun käyttäytymistä. FGF-proteiinin (ligandi) sitoutumisesta aktivoitunut FGF-reseptori vaikuttaa monien geenien aktiivisuuteen ja sitä kautta säätelee, joko lisää tai vähentää, lukuisien geenien ilmenemistä (geeniekspressiota). Tällä FGF-FGFR-signaalinvälityksellä geenien aktiivisuus ja ilmeneminen vaikuttavat mm. solusyklin säätelyyn ja saavat aikaan muutoksia solun jakautumisessa (proliferaatio) tai niiden erilaistumisessa. Keski- ja taka-aivojen väliseltä alueelta (IsO:sta) välittyvät signaalit (FGF, WNT1 ja SHH) ohjaavat mm. taka-aivojen alueelta syntyvien rakenteiden kehitystä. IsO:n aktiivisuus säätelee mm. taka-aivojen alueelta syntyvien pikkuaivojen ja serotonergisten (SA) neuronien sekä ventraalisessa keskiaivoissa sijaisevien dopaminergisten (DA) neuronien kehitystä. Pikkuaivoilla on keskeinen tehtävä koordinoida liikesarjoja, lihasliikkeitä ja tasapainoa sekä säädellä sekä hieno- että karkeamotoriikkaa. DA-neuronit osallistuvat liikkeiden säätelyyn, tunnetilojen säätelyyn sekä hormonineritykseen. Parkinsonin taudissa havaittavien motoristen oireiden syynä ovat DA-neuronien tuhoutuminen. Väitöstutkimuksen tarkoitus oli löytää uusia geenejä, jotka vaikuttavat keski- ja taka-aivojen välisellä alueen kehitykseen ja / tai IsO:n syntyyn, ylläpitoon ja kehitykseen. Tarkoituksena oli myös selvittää solumekanismeja, jotka vaikuttavat morfologisesti selkeän rajapinnan syntyyn keski- ja taka-aivojen väliselle alueelle sekä vierekkäisten aivoalueiden erilaiseen erilaistumiseen ja kehitykseen. Tutkimuksessa analysoitiin poistogeenisen FGFR1 hiiren geeniekspression muutoksia keski- ja taka-aivojen alueella käyttäen hyväksi DNA-mikrosirutekniikkaa. Analyysin tuloksena havaittiin monien solun jakautumista säätelevien geenien, kuten proteiineja fosforiloivan MAPK-reaktiotien geenien, ekspression väheneminen FGFR1 poistogeenisissä hiirissä. Mikrosiruanalyysin tulokset osoittivat myös muutoksia hermosolujen erilaistumista (neurogeneesi) säätelevien geenien ekspressiotasoissa. Lisäksi havaitsimme ennestään tuntemattomia geenejä, jotka ilmenivät spesifisesti keksi- ja taka-aivojen alueella. Näistä Cnpy1 osoittautui olevan vuorovaikutuksessa FGFR1-proteiinin kanssa ja voimistavan FGFR1-signalointia spesifisesti keski- ja taka-aivojen välisellä alueella. DNA-mikrosiruanalyysin avulla havaittiin myös mahdollisesti WNT-signalointiin liittyvä geeni, joka nimettiin Drapc1:ksi ihmisen ortologisen geenin mukaan. Drapc1-geenin havaittiin olevan aktiivinen useissa erilaisissa solupopulaatioissa alkionkehityksen aikana, mutta oletettavasti solukalvolla sijaitsevan DRAPC1-proteiinin tehtävä on vielä epäselvä. Tutkimuksessa selvitettiin myös FGFR-signaloinnin merkitystä keskiaivojen DA-neuronien ja taka-aivojen SA-neuronien kehitykseen ja lokalisaatioon. Väitöskirjatyössä havaittiin myös, että keski- ja taka-aivojen rajapinnalla olevan ohuen solukerroksen proliferaatio on merkittävästi alhaisempi kuin viereisten solupopulaatioiden. Solutason analyysit osoittivat, että tällä mekanismilla voi olla merkitystä mm. erilaisten solupopulaatioiden sekoittumisen estossa keski- ja taka-aivojen välillä. Tutkimustuloksemme selvittivät FGFR1:n roolia keski- ja taka-aivojen rajapinnalla ja IsO:n sääätelemien geenien ekspressiossa sekä FGF-FGFR1 signaloinnin merkitystä DA- ja SA-neuronien kehityksessä.