Functional and cellular analysis of autoimmune regulator (AIRE) protein

Autoimmune diseases are a major health problem. Usually autoimmune disorders are multifactorial and their pathogenesis involves a combination of predisposing variations in the genome and other factors such as environmental triggers. APECED (autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy) is a rare, recessively inherited, autoimmune disease caused by mutations in a single gene. Patients with APECED suffer from several organ-specific autoimmune disorders, often affecting the endocrine glands. The defective gene, AIRE, codes for a transcriptional regulator. The AIRE (autoimmune regulator) protein controls the expression of hundreds of genes, representing a substantial subset of tissue-specific antigens which are presented to developing T cells in the thymus and has proven to be a key molecule in the establishment of immunological tolerance. However, the molecular mechanisms by which AIRE mediates its functions are still largely obscure. The aim of this thesis has been to elucidate the functions of AIRE by studying the molecular interactions it is involved in by utilizing different cultured cell models. A potential molecular mechanism for exceptional, dominant, inheritance of APECED in one family, carrying a glycine 228 to tryptophan (G228W) mutation, was described in this thesis. It was shown that the AIRE polypeptide with G228W mutation has a dominant negative effect by binding the wild type AIRE and inhibiting its transactivation capacity in vitro. The data also emphasizes the importance of homomultimerization of AIRE in vivo. Furthermore, two novel protein families interacting with AIRE were identified. The importin alpha molecules regulate the nuclear import of AIRE by binding to the nuclear localization signal of AIRE, delineated as a classical monopartite signal sequence. The interaction of AIRE with PIAS E3 SUMO ligases, indicates a link to the sumoylation pathway, which plays an important role in the regulation of nuclear architecture. It was shown that AIRE is not a target for SUMO modification but enhances the localization of SUMO1 and PIAS1 proteins to nuclear bodies. Additional support for the suggestion that AIRE would preferably up-regulate genes with tissue-specific expression pattern and down-regulate housekeeping genes was obtained from transactivation studies performed with two models: human insulin and cystatin B promoters. Furthermore, AIRE and PIAS activate the insulin promoter concurrently in a transactivation assay, indicating that their interaction is biologically relevant. Identification of novel interaction partners for AIRE provides us information about the molecular pathways involved in the establishment of immunological tolerance and deepens our understanding of the role played by AIRE not only in APECED but possibly also in several other autoimmune diseases.

Autoimmuunisairaudet, kuten diabetes, ovat huomattava kansanterveydellinen ongelma. Yleensä autoimmuunisairaus syntyy usean perinnöllisen ja ympäristöstä johtuvan tekijän summana. APECED (autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy) on peittyvästi periytyvä harvinainen autoimmuunisairaus. Siinä yksi virheellinen geeni riittää taudin puhkeamiseen. Potilailla esiintyy useita eri elimiin kohdistuvia autoimmuunisairauksia, jotka ovat seurausta kudostuhosta mm. hormonirauhasissa. APECED-taudissa virheellinen geeni, AIRE (autoimmune regulator), koodaa kateenkorvassa toimivaa geenien ilmentymisen säätelijäproteiinia. AIREn säätelemät kohdegeenit ohjaavat kehittyviä puolustussoluja, T-soluja, erottamaan kehon omat rakenteet vieraista. AIRE on näin ollen osoittautunut hyvin tärkeäksi ns. immunologisen toleranssin synnylle. AIREn toiminnan mekanismeista tiedetään kuitenkin vielä varsin vähän. Tässä väitöskirjatutkimuksessa on pyritty valaisemaan AIRE-proteiinin toimintaa tutkimalla erilaisissa solumalleissa AIREn vuorovaikutuksia itsensä ja muiden molekyylien kanssa. Väitöskirjassa kuvattiin mahdollinen mekanismi APECEDin poikkeukselliselle, yhdessä perheessä havaitulle, vallitsevalle periytymiselle. Kyseisen perheen jäsenillä esiintyvä viallinen AIRE-proteiinin muoto kykenee sitomaan tervettä AIRE-proteiinia ja estämään sen toiminnan. Tutkimuksessa kuvattiin lisäksi kaksi uutta proteiiniperhettä, joiden kanssa AIRE on vuorovaikutuksessa. Importiini alfa -proteiini säätelee AIREn tumakuljetusta sitoutuen sen yksiosaiseen klassiseen tumakuljetussignaaliin. AIREn vuorovaikutus E3 SUMO ligaaseina toimivien PIAS-proteiinien kanssa viittaa AIREn ja sumoylaation yhteyteen. Sumoylaatio on yksi keskeisiä tuman toiminnallisen järjestyksen säätelijöitä. Tutkimuksessa osoitettiin, että AIREa itseään ei sumoyloida, mutta AIRE tehostaa SUMO1- ja PIAS1-proteiinien sijoittumista pistemäisiin tumarakenteisiin. Kahdella mallipromoottorilla saadut tutkimustulokset tukevat aiempaa havaintoa, jonka mukaan AIRE pääosin aktivoi kudosspesifisiä geenejä ja inhiboi useissa kudoksissa toimivia ns. ylläpitogeenejä. Lisäksi AIRE- ja PIAS1-proteiinit yhdessä säätelevät insuliinipromoottorin, tunnetun AIREn säätelykohteen, aktiivisuutta osoittaen, että vuorovaikutus on biologisesti merkityksellinen. Uusien AIREn kanssa vuorovaikutuksessa olevien proteiinien tunnistaminen lisää tietoamme siitä, mitkä säätelyreitit osallistuvat immunologisen toleranssin syntyyn ja ylläpitoon. Tämä on tärkeää, jotta ymmärtäisimme paremmin autoimmuunisairauksien syntymekanismeja.