Lignin biosynthesis in Norway spruce: from a model system to the tree

Lignin is a hydrophobic polymer that is synthesised in the secondary cell walls of all vascular plants. It enables water conduction through the stem, supports the upright growth habit and protects against invading pathogens. In addition, lignin hinders the utilisation of the cellulosic cell walls of plants in pulp and paper industry and as forage. Lignin precursors are synthesised in the cytoplasm through the phenylpropanoid pathway, transported into the cell wall and oxidised by peroxidases or laccases to phenoxy radicals that couple to form the lignin polymer. This study was conducted to characterise the lignin biosynthetic pathway in Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.). We focused on the less well-known polymerisation stage, to identify the enzymes and the regulatory mechanisms that are involved. Available data for lignin biosynthesis in gymnosperms is scarce and, for example, the latest improvements in precursor biosynthesis have only been verified in herbaceous plants. Therefore, we also wanted to study in detail the roles of individual gene family members during developmental and stress-induced lignification, using EST sequencing and real-time RT-PCR. We used, as a model, a Norway spruce tissue culture line that produces extracellular lignin into the culture medium, and showed that lignin polymerisation in the tissue culture depends on peroxidase activity. We identified in the culture medium a significant NADH oxidase activity that could generate H2O2 for peroxidases. Two basic culture medium peroxidases were shown to have high affinity to coniferyl alcohol. Conservation of the putative substrate-binding amino acids was observed when the spruce peroxidase sequences were compared with other peroxidases with high affinity to coniferyl alcohol. We also used different peroxidase fractions to produce synthetic in vitro lignins from coniferyl alcohol; however, the linkage pattern of the suspension culture lignin could not be reproduced in vitro with the purified peroxidases, nor with the full complement of culture medium proteins. This emphasised the importance of the precursor radical concentration in the reaction zone, which is controlled by the cells through the secretion of both the lignin precursors and the oxidative enzymes to the apoplast. In addition, we identified basic peroxidases that were reversibly bound to the lignin precipitate. They could be involved, for example, in the oxidation of polymeric lignin, which is required for polymer growth. The dibenzodioxocin substructure was used as a marker for polymer oxidation in the in vitro polymerisation studies, as it is a typical substructure in wood lignin and in the suspension culture lignin. Using immunolocalisation, we found the structure mainly in the S2+S3 layers of the secondary cell walls of Norway spruce tracheids. The structure was primarily formed during the late phases of lignification. Contrary to the earlier assumptions, it appears to be a terminal structure in the lignin macromolecule. Most lignin biosynthetic enzymes are encoded for by several genes, all of which may not participate in lignin biosynthesis. In order to identify the gene family members that are responsible for developmental lignification, ESTs were sequenced from the lignin-forming tissue culture and developing xylem of spruce. Expression of the identified lignin biosynthetic genes was studied using real-time RT-PCR. Candidate genes for developmental lignification were identified by a coordinated, high expression of certain genes within the gene families in all lignin-forming tissues. However, such coordinated expression was not found for peroxidase genes. We also studied stress-induced lignification either during compression wood formation by bending the stems or after Heterobasidion annosum infection. Based on gene expression profiles, stress-induced monolignol biosynthesis appeared similar to the developmental process, and only single PAL and C3H genes were specifically up-regulated by stress. On the contrary, the up-regulated peroxidase genes differed between developmental and stress-induced lignification, indicating specific responses.

Ligniini on selluloosan jälkeen yleisin kasvien tuottama polymeeri. Se sijaitsee kasvien soluseinissä ja on välttämätön mm. vettä johtavien solukoiden toiminnan kannalta, tukirakenteena ja suojana tuhohyönteisiä ja tauteja vastaan. Suuri osa maapallon ligniinistä on puissa, sillä puusolukon, ksyleemin, painosta jopa kolmannes on ligniiniä. Ligniini heikentää kasvi- ja puukuitujen hyötykäyttöä, esimerkiksi eläinrehun sulavuutta ja paperinvalmistusprosessien tehokkuutta. Näin ollen ligniinillä on myös huomattava taloudellinen ja ympäristönsuojelullinen merkitys. Ligniini on osa laajaa fenyylipropanoidien ryhmää, johon kuuluu erilaisia, mm. kasvien väreihin, rakenteisiin ja puolustukseen liittyviä aineita. Ligniini rakentuu kolmesta alayksiköstä, joiden muodostukseen osallistuvat geeni- ja entsyymiperheet osallistuvat myös muiden fenyylipropanoidien tuottoon. Selvitimme ligniinin alayksikköjen syntyyn liittyvien geeniperheiden roolia ligniinin tuotossa tutkimalla geenien ilmentymistä ligniiniä muodostavissa solukoissa. Jokaisesta geeniperheestä yksi geeni ilmentyi muita voimakkaammin kehittyvässä puusolukossa, niin nuorissa taimissa kuin vanhemmissa puissa. Nämä geenit todennäköisesti vastaavat ligniinin tuotosta kuusessa, ja ne ovat mahdollisia kohteita esimerkiksi metsäpuiden jalostuksessa ligniinin määrän tai laadun suhteen. Työssä selvitettiin myös stressiperäisen ja luonnollisen ligniinin muodostuksen välistä suhdetta geenitasolla. Stressiligniinin muodostus saatiin aikaan joko sieni-infektiolla (juurikääpä) tai taivuttamalla taimia. Molempien stressien seurauksena muodostuu enemmän ja osin rakenteeltaan erilaista ligniiniä. Geenien ilmenemisen tasolla stressiligniinin muodostus oli samankaltaista kuin normaalisti kehittyvässä puussa. Ligniinin muodostuksen alkuvaiheessa aktivoitui kaksi uutta geeniä, jotka todennäköisesti lisäävät ligniinin kokonaismäärää sekä ohjaavat eri alayksiköiden määräsuhteita. Ligniinin alayksiköistä muodostetaan verkkomainen polymeeri peroksidaasi- ja/tai lakkaasientsyymien toimesta. Molemmat ovat suurten geeniperheiden tuotteita, joten ligniinin polymerisaatiosta vastaavia yksittäisiä geenejä ei täysin tunneta, kuten ei myöskään polymerisaation säätelymekanismeja. Tutkimme näitä vaiheita entsyymitasolla kuusen solukkoviljelmässä, joka tuottaa luonnollisen kaltaista ligniiniä kasvualustaansa. Osoitimme, että ligniinin tuotto on peroksidaaseista riippuvaista, ja löysimme kaksi peroksidaasia, jotka olivat erikoistuneet ligniinin alayksiköiden hapetukseen. Tuotimme näillä peroksidaaseilla keinotekoista ligniiniä koeputkessa ja havaitsimme, että se sisälsi vain vähän luonnollisen kaltaisen ligniinin merkkirakenteita. Samaan tulokseen päädyttiin käytettäessä kaikkia kasvualustasta eristettyjä proteiineja yhdessä. Tämä osoittaa että peroksidaasien lisäksi tai niiden sijasta jokin muu tekijä säätelee ligniinin kokonaisrakennetta solukkoviljelmässä. Eräs mahdollinen tekijä on ligniinin rakenneyksiköiden pitoisuus kasvatusalustassa. Elävät solut kontrolloivat pitoisuutta tarkemmin kuin mihin koeputkituoton aikana kyetään. Havaitsimme myös pienempiä eroja solukkoviljelmäligniinin ja puusta eristetyn ligniinin välillä. Nämä erot vahvistavat teoriaa, jonka mukaan puusolukon soluseinät vaikuttavat oleellisesti syntyvän ligniinin rakenteeseen. Osa solukkoviljelmän peroksidaasientsyymeistä pystyi sitoutumaan erityyppisiin ligniineihin. Sitoutumiskyvyn perusteella voidaan olettaa, että nämä peroksidaasit ovat ligniinin tärkeitä ligniinin polymerisaation kannalta. Lisäksi työssä tuotettiin vasta-aineita erästä luonnollisen ligniinin merkkirakennetta vastaan. Vasta-aineiden avulla paikallistimme rakenteen soluseinän pintakerroksiin. Tämä rakenne on todennäköisesti ligniinin pääterakenne, joka mahdollisesti vaikuttaa ligniinin käyttäytymiseen esimerkiksi sellun keittoprosesseissa.