U12-type Spliceosome: Localization and Effects of Splicing Efficiency on Gene Expression

The removal of non-coding sequences, introns, is an essential part of messenger RNA processing. In most metazoan organisms, the U12-type spliceosome processes a subset of introns containing highly conserved recognition sequences. U12-type introns constitute less than 0,5% of all introns and reside preferentially in genes related to information processing functions, as opposed to genes encoding for metabolic enzymes. It has previously been shown that the excision of U12-type introns is inefficient compared to that of U2-type introns, supporting the model that these introns could provide a rate-limiting control for gene expression. The low efficiency of U12-type splicing is believed to have important consequences to gene expression by limiting the production of mature mRNAs from genes containing U12-type introns. The inefficiency of U12-type splicing has been attributed to the low abundance of the components of the U12-type spliceosome in cells, but this hypothesis has not been proven. The aim of the first part of this work was to study the effect of the abundance of the spliceosomal snRNA components on splicing. Cells with a low abundance of the U12-type spliceosome were found to inefficiently process U12-type introns encoded by a transfected construct, but the expression levels of endogenous genes were not found to be affected by the abundance of the U12-type spliceosome. However, significant levels of endogenous unspliced U12-type intron-containing pre-mRNAs were detected in cells. Together these results support the idea that U12-type splicing may limit gene expression in some situations. The inefficiency of U12-type splicing has also promoted the idea that the U12-type spliceosome may control gene expression, limiting the mRNA levels of some U12-type intron-containing genes. While the identities of the primary target genes that contain U12-type introns are relatively well known, little has previously been known about the downstream genes and pathways potentially affected by the efficiency of U12-type intron processing. Here, the effects of U12-type splicing efficiency on a whole organism were studied in a Drosophila line with a mutation in an essential U12-type spliceosome component. Genes containing U12-type introns showed variable gene-specific responses to the splicing defect, which points to variation in the susceptibility of different genes to changes in splicing efficiency. Surprisingly, microarray screening revealed that metabolic genes were enriched among downstream effects, and that the phenotype could largely be attributed to one U12-type intron-containing mitochondrial gene. Gene expression control by the U12-type spliceosome could thus have widespread effects on metabolic functions in the organism. The subcellular localization of the U12-type spliceosome components was studied as a response to a recent dispute on the localization of the U12-type spliceosome. All components studied were found to be nuclear indicating that the processing of U12-type introns occurs within the nucleus, thus clarifying a question central to the field. The results suggest that the U12-type spliceosome can limit the expression of genes that contain U12-type introns in a gene-specific manner. Through its limiting role in pre-mRNA processing, the U12-type splicing activity can affect specific genetic pathways, which in the case of Drosophila are involved in metabolic functions.

Aitotumallisissa eliöissä, joihin kuuluvat mm. kaikki monisoluiset eläimet ja kasvit, useimmat geenit ovat epäjatkuvia: koodaavat alueet vuorottelevat niissä ei-koodaavien jaksojen eli intronien kanssa. Geeni luetaan kokonaisuudessaan lähetti-RNA:ksi, minkä jälkeen intronit on poistettava toimivan lähetin tuottamiseksi. Intronien poiston eli silmukoinnin suorittaa moniosainen molekyylikoneisto, spliseosomi. Useimmilla monisoluisilla eliöillä on kaksi erilaista silmukointikoneistoa: U2-tyypin spliseosomi poistaa useimmat intronit, kun taas U12-tyypin spliseosomilla on tietyt kohdeintronit, jotka se löytää erityisten tunnistusjaksojen perusteella. Väitöskirjatyössäni olen tutkinut U12-tyypin spliseosomin erityispiirteitä, jotka eroavat yleisestä U2-tyypin silmukointikoneistosta ja tekevät U12-spliseosomista mahdollisen geeninsäätelymekanismin. Muutokset geeninsäätelyssä ovat esimerkiksi solujen erilaistumisen ja ympäristöön reagoimisen perusta, mikä tekee säätelymekanismeista keskeisen tutkimuskohteen molekyylibiologiassa. U12-tyypin intronien silmukoinnin on aiemmin havaittu olevan hitaampaa kuin tavallisen U2-tyypin, mikä viittaa siihen, että U12-tyypin introni voisi rajoittaa geenin toimintaa muodostamalla pullonkaulan lähetti-RNA:n muokkauksessa. U12-tyypin introneja esiintyy lähinnä geeneissä, joiden tehtävät liittyvät geneettisen informaation säilyttämiseen ja toimintaan soluissa, kuten DNA:n kopiointiin, geenien säätelyyn ja luentaan sekä solujenväliseen viestintään. On arveltu, että U12-tyypin silmukointi voi toimia tällaisten geenien säätelykeinona. Väitöskirjatyössäni havaittiin, että soluissa on normaalisti runsaasti lähetti-RNA:ita, joissa on silmukoimattomia U12-tyypin introneita, mikä viittaa siihen, että U12-tyypin silmukointi todella rajoittaa geenien ilmentymistä. Lisäksi todettiin, että U12-tyypin spliseosomin komponenttien määrä voi olla silmukointia rajoittava tekijä ainakin joissakin olosuhteissa. U12-tyypin intronin sisältävät geenit tunnetaan monissa eliöissä, mutta ei tiedetä, minkä geenien toimintaan ne puolestaan vaikuttavat. Tässä työssä U12-tyypin spliseosomin toiminnan estämisen vaikutuksia tutkittiin banaanikärpäsessä. Banaanikärpäsellä on vähemmän U12-tyypin introneja kuin esimerkiksi ihmisellä, mutta ihmisellä on U12-tyypin introni lähes kaikissa samoissa geeneissä kuin kärpäselläkin, mikä viittaa siihen, että U12-tyypin introneilla on tärkeä merkitys, jonka vuoksi ne säilyvät evoluutiossa. Tutkimuksissa havaittiin, että U12-tyypin silmukoinnin estäminen vaikutti ennen kaikkea perusaineenvaihduntaan sekä mitokondrioiden, solujen energiatehtaiden, toimintaan liittyviin geeneihin. Täten U12-tyypin spliseosomin aktiivisuuden taso voi vaikuttaa aivan eri tyyppisten geenien toimintaan kuin aiemmin on ajateltu. Kahden erillisen spliseosomikoneiston olemassaoloa on aiemmin pyritty selittämään myös ehdottamalla, että U12-tyypin spliseosomi toimisi solun tuman sijasta tuman ulkopuolella solulimassa. Tässä työssä selvitettiin U12-tyypin spliseosomin osien sijaintia solussa ja todettiin niiden sijaitsevan lähes yksinomaan tumassa. Tulos sopii hyvin yhteen sen kanssa, mitä ennestään tiedetään silmukoinnin yhteydestä muihin lähetti-RNA:ta muokkaaviin molekyylikoneistoihin, jotka myös toimivat tuman sisällä. Nämä ja muut viimeaikaiset tulokset viittaavat siihen, että syy toisen erillisen silmukointikoneiston ylläpitämiseen ei ole erilainen solunsisäinen sijainti vaan U12-tyypin spliseosomin rooli geeninsäätelyssä.