Peroxidases in lignifying xylem of Norway spruce, Scots pine and silver birch

Lignin is a complex plant polymer synthesized through co-operation of multiple intracellular and extracellular enzymes. It is deposited to plant cell walls in cells where additional strength or stiffness are needed, such as in tracheary elements (TEs) in xylem, supporting sclerenchymal tissues and at the sites of wounding. Class III peroxidases (POXs) are secreted plant oxidoreductases with implications in many physiological processes such as the polymerization of lignin and suberin and auxin catabolism. POXs are able to oxidize various substrates in the presence of hydrogen peroxide, including lignin monomers, monolignols, thus enabling the monolignol polymerization to lignin by radical coupling. Trees produce large amounts of lignin in secondary xylem of stems, branches and roots. In this study, POXs of gymnosperm and angiosperm trees were studied in order to find POXs which are able to participate in lignin polymerization in developing secondary xylem i.e. are located at the site of lignin synthesis in tree stems and have the ability to oxidize monolignol substrates. Both in the gymnosperm species, Norway spruce and Scots pine, and in the angiosperm species silver birch the monolignol oxidizing POX activities originating from multiple POX isoforms were present in lignifying secondary xylem in stems during the period of annual growth. Most of the partially purified POXs from Norway spruce and silver birch xylem had highest oxidation rate with coniferyl alcohol, the main monomer in guaiacyl-lignin in conifers. The only exception was the most anionic POX fraction from silver birch, which clearly preferred sinapyl alcohol, the lignin monomer needed in the synthesis of syringyl-guaiacyl lignin in angiosperm trees. Three full-length pox cDNAs px1, px2 and px3 were cloned from the developing xylem of Norway spruce. It was shown that px1 and px2 are expressed in developing tracheids in spruce seedlings, whereas px3 transcripts were not detected suggesting low transcription level in young trees. The amino acid sequences of PX1, PX2 and PX3 were less than 60% identical to each other but showed up to 84% identity to other known POXs. They all begin with predicted N-terminal secretion signal (SS) peptides. PX2 and PX3 contained additional putative vacuolar localization determinants (VSDs) at C-terminus. Transient expression of EGFP-fusions of the SS- and VSD-peptides in tobacco protoplasts showed SS-peptides directed EGFP to secretion in tobacco cells, whereas only the PX2 C-terminal peptide seems to be a functional VSD. According to heterologous expression of px1 in Catharanthus roseus hairy roots, PX1 is a guaicol-oxidizing POX with isoelectric point (pI) approximately 10, similar to monolignol oxidizing POXs in protein extracts from Norway spruce lignifying xylem. Hence, PX1 has characteristics for participation to monolignol dehydrogenation in lignin synthesis, whereas the other two spruce POXs seem to have some other functions. Interesting topics in future include functional characterization of syringyl compound oxidizing POXs and components of POX activity regulation in trees.

Ligniini on kasvisoluseinien polymeeriyhdiste, jota solut valmistavat vahvistamaan soluseiniä erityisesti kasvien tukirakenteissa, vedenkuljetukseen erikoistuneissa soluissa ja esimerkiksi taudinaiheuttajien hyökätessä. Puiden kasvaessa paksuutta niiden runkoihin muodostuu suuria määriä veden kuljetukseen erikoistuneita ja tukirakenteena toimivia soluja, joiden soluseinissä ligniinin määrä on suuri. Ligniinillä on vaikutusta puiden hyötykäyttöön: se lujittaa puiden runkoja ja kasvattaa niiden lämpöarvoa, mutta toisaalta paperin valmistuksessa ligniini täytyy poistaa paperin tummumisen ehkäisemiseksi. Ligniinin määrä ja laatu puissa vaihtelee ja tämän vaihtelun biologisten syiden ymmärtäminen voi auttaa myös eri tarkoituksiin sopivien puumateriaalien kasvattamista. Ligniinin muodostumisen viimeisessä vaiheessa ligniinin alayksiköt liittyvät yhteen eli polymerisoituvat soluseinässä verkkomaiseksi ligniinipolymeeriksi. Ennen polymerisaatiota ligniinin alayksiköt hapetetaan entsyymien välityksellä. Peroksidaasit ovat ryhmä entsyymejä, joilla on kasveissa monia tärkeitä tehtäviä, ja niiden ajatellaan toimivan myös ligniinin alayksikköjen hapettajina ligniinin muodostumisessa. Peroksidaasien suuren lukumäärän ja samankaltaisen toiminnan takia erityisesti ligniinin valmistamiseen osallistuvia entsyymejä on kuitenkin vaikea osoittaa. Tässä väitöstutkimuksessa selvitettiin peroksidaasien toimintaa havu- ja lehtipuiden (metsäkuusen, metsämännyn ja rauduskoivun) ligniinin muodostumisessa etsimällä puiden rungoista eristettyjen peroksidaasien joukosta niitä, jotka sijaitsevat ligniiniä tuottavien solujen soluseinissä ja kykenevät hapettamaan niitä ligniinin alayksikköjä, joista ligniini kyseisillä puulajeilla koostuu. Kaikilla kolmella puulajilla havaittiin ligniiniä tuottavassa solukossa kasvukauden aikana useita ligniinin alayksikköjä hapettavia peroksidaaseja. Valtaosa näistä peroksidaaseista hapetti parhaiten koniferyylialkoholia, joka muodostaa pääosan havupuiden ja myös osan lehtipuiden ligniinistä. Yksi koivusta eristetyistä peroksidaaseista kuitenkin hapetti parhaiten lehtipuiden ligniinille tyypillistä sinapyylialkoholia, mikä viittaa siihen että tämä peroksidaasi voi toimia koivun ligniinin muodostumisessa. Peroksidaasien sijaintia rungossa ja ohjautumista solun eri osiin tutkittiin tarkemmin kuusessa. Tutkituista kolmesta peroksidaasista ainakin yhden sijainti ja muut ominaisuudet vastasivat mahdollisesti ligniinin muodostumisessa toimivia peroksidaaseja, kun taas muut tutkituista peroksidaaseista toimivat todennäköisesti muissa tehtävissä. Tulevaisuuden mielenkiintoisia kysymyksiä puiden peroksidaasitutkimuksessa ovat esimerkiksi sinapyylialkoholia hapettavien peroksidaasien rakenteen ja toiminnan selvittäminen ja eri peroksidaasien toiminnan säätely ja sen vaikutukset puiden ligniinin määrään ja laatuun.