Role of cell cycle regulators in development of the inner ear

The inner ear originates from an ectodermal thickening called the otic placode. The otic placode invaginates and closes to an otic vesicle, the otocyst. The otocyst epithelium undergoes morphogenetic changes and cell differentiation, leading to the formation of the labyrinth-like mature inner ear. Epithelial-mesenchymal interactions control inner ear morphogenesis, but the modes and molecules are largely unresolved. The expressions of negative cell cycle regulators in the epithelium of the early-developing inner ear have also not been elucidated. The mature inner ear comprises the hearing (cochlea) and balance (vestibular) organs that contain the nonsensory and sensory cells. In mammals, the inner ear sensory cells, called hair cells, exit the cell cycle during embryogenesis and are mitotically quiescent during late-embryonic differentiation stages and postnatally. The mechanisms that maintain this hair cell quiescense are largely unresolved. In this work I examined 1) the epithelial-mesenchymal interactions involved in inner ear morphogenesis, 2) expression of negative cell cycle regulators in the epithelium of the early developing inner ear and 3) the molecular mechanisms that maintain the postmitotic state of inner ear sensory cells. We observed that during otocyst stages, epithelial fibroblast growth factor 9 (Fgf9) communicates with the surrounding mesenchyme, where its receptors are expressed. Fgf9 inactivation leads to reduced proliferation of the surrounding vestibular mesenchyme and to the absence of semicircular canals. Semicircular canal development is blocked, since fusion plates do not form. These results show that the mesenchyme directs fusion plate formation and give direct evidence for the existence of reciprocal epithelial-mesenchymal interactions in the developing inner ear. Cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs) are negative regulators of proliferation. We show that the members of the Cip/Kip family of CKIs (p21Cip1, p27Kip1 and p57Kip2) are expressed in the early-developing inner ear. Our expression data suggest that CKIs divide the otic epithelium into proliferative and nonproliferative compartments that may underlie shaping of the otocyst. At later stages, CKIs regulate proliferation of the vestibular appendages, and this may regulate their continual growth. In addition to restricting proliferation, CKIs may play a role in regional differentiation of various epithelial cells. Differentiating and adult inner ear hair cells are postmitotic and do not proliferate in response to serum or mitogenic growth factors. In our study, we show that this is the result of the activity of negative cell cycle regulators. Based on expression profiles, we first focused on the retinoblastoma (Rb) gene, which functions downstream of the CKIs. Analysis of the inner ear phenotype of Rb mutant mice show, that the retinoblastoma protein regulates the postmitotic state of hair cells. Rb inactivation leads to hyperplasia of vestibular and cochlear sensory epithelia that is a result of abnormal cell cycle entry of differentiated hair cells and of delayed cell cycle exit of the hair cell precursor cells. In addition, we show that p21Cip1 and p19Ink4d cooperate in maintaining the postmitotic state of postnatal auditory hair cells. Whereas inactivation of p19Ink4d alone leads to low-level S-phase entry (Chen et al., 2003) and p21Cip1 null mutant mice have a normal inner ear phenotype, codeletion of p19Ink4d and p21Cip1 triggers high-level S-phase entry of auditory hair cells during early postnatal life, which leads to supernumerary hair cells. The ectopic hair cells undergo apoptosis in all of the mutant mice studied, DNA damage being the immediate cause of this death. These findings demonstrate that the maintenance of the postmitotic state of hair cells is regulated by Rb and several CKIs, and that these cell cycle regulators are critical for the lifelong survival of hair cells. These data have implications for the future design of therapies to induce hair cell regrowth.

Sisäkorvan kehitys alkaa ektodermin paksuuntumasta, joka kuroutuu muodostaen korvarakkulan. Sisäkorva kuulo- ja tasapainoelimineen kehittyy korvarakkulan epiteelin ja sitä ympäröivän kudoksen, mesenkyymin, vuoropuhelun seurauksena. Mekanismit ja molekyylit tämän vuoropuhelun takana ovat kuitenkin olleet epäselviä. Sisäkorvan kuulo- ja tasapainoelimissä sijaitsevat aistinsolut (karvasolut). Linnuilla ja kaloilla luonnollista karvasolujen uusiutumista tapahtuu koko eliniän aikana ja traumojen jälkeen uusiutumisprosessi kiihtyy. Nisäkkäillä uusia karvasoluja ei synny sikiövaiheen terminaalimitoosien jälkeen. Tästä syystä karvasolujen tuhoutuminen esim. melun, tiettyjen sairauksien tai ototoksisten antibioottien seurauksena on pysyvää. Tässä väitöskirjatyössä on selvitetty 1) sisäkorvan epiteelin ja sitä ympäröivän mesenkyymin vuoropuhelun sekä negatiivisten solusyklin säätelijöiden roolia sisäkorvan muotoutumisessa ja 2) negatiivisten solusyklin säätelijöiden roolia nisäkkäiden karvasolujen postmitoottisen tilan ylläpitämisessä. Tässä työssä osoitamme, kuinka sisäkorvan epiteelissä ilmentyvä fibroblastinen kasvutekijä 9 vuoropuhelee ympäröivässä mesenkyymissä sijaitsevien reseptoreidensa kanssa vaikuttaen näin sisäkorvan muotoutumiseen. Sykliinistä riippuva kinaasi-inhiibiittori (CKI) perhe (p21Cip1, p27Kip1 and p57Kip2) sekä retinoblastoma (Rb) perhe (Rb, p107, 130) muodostavat osan negatiivisista solusyklin säätelijöistä. CKI perheen jäsenet ilmentyvät kehittyvän sisäkorvan epiteelissä rajoittaen solunjakaantumista alueittain. Tämä mahdollistaa etenkin tasapainoelinten monimutkaisen muotoutumisen. Tämä työ osoittaa myös, kuinka negatiiviset solusyklin säätelijät ylläpitävät karvasolujen postmitoottista tilaa. Geenien ilmentymisen perusteella perehdyimme retinoblastoma geenin (Rb) sekä geenien p19Ink4d ja p21Cip1 rooliin karvasolujen postmitoottisen tilan säätelyssä. Retinoblastoma geenin inaktivaatio johtaa karvasolujen esiasteiden määrän kasvuun terminaalimitoosien viivästyessä ja normaalisti postmitoottisten karvasolujen jakaantumiseen. Näiden tekijöiden seurauksena sisäkorvassa muodostuu ylimääräisiä karvasoluja. Toisten negatiivisten solusyklin säätelijägeenien, p19Ink4d ja p21Cip1, toiminnan esto johtaa postmitoottisten karvasolujen jakaantumiseen syntymän jälkeisessä kuuloelimessä. Kaikissa edellä mainituissa tapauksissa ylimääräiset karvasolut kuitenkin DNA vaurion seurauksena kuolevat. Nämä tulokset osoittavat kuinka karvasolujen postmitoottista tilaa säätelevät useat eri negatiiviset solusyklin säätelijät. Näiden säätelijöiden normaali toiminta on myös edellytys karvasolujen elinkyvylle. Ymmärrys karvasolujen postmitoottisen tilan ylläpidosta auttaa kehittämään karvasolujen regeneratiivista terapiaa.