Engineering the pentose phosphate pathway of Saccharomyces cerevisiae for production of ethanol and xylitol

The baker s yeast Saccharomyces cerevisiae has a long tradition in alcohol production from D-glucose of e.g. starch. However, without genetic modifications it is unable to utilise the 5-carbon sugars D-xylose and L arabinose present in plant biomass. In this study, one key metabolic step of the catabolic D-xylose pathway in recombinant D-xylose-utilising S. cerevisiae strains was studied. This step, carried out by xylulokinase (XK), was shown to be rate-limiting, because overexpression of the xylulokinase-encoding gene XKS1 increased both the specific ethanol production rate and the yield from D xylose. In addition, less of the unwanted side product xylitol was produced. Recombinant D-xylose-utilizing S. cerevisiae strains have been constructed by expressing the genes coding for the first two enzymes of the pathway, D-xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH) from the D-xylose-utilising yeast Pichia stipitis. In this study, the ability of endogenous genes of S. cerevisiae to enable D-xylose utilisation was evaluated. Overexpression of the GRE3 gene coding for an unspecific aldose reductase and the ScXYL2 gene coding for a xylitol dehydrogenase homologue enabled growth on D-xylose in aerobic conditions. However, the strain with GRE3 and ScXYL2 had a lower growth rate and accumulated more xylitol compared to the strain with the corresponding enzymes from P. stipitis. Use of the strictly NADPH-dependent Gre3p instead of the P. stipitis XR able to utilise both NADH and NADPH leads to a more severe redox imbalance. In a S. cerevisiae strain not engineered for D-xylose utilisation the presence of D-xylose increased xylitol dehydrogenase activity and the expression of the genes SOR1 or SOR2 coding for sorbitol dehydrogenase. Thus, D-xylose utilisation by S. cerevisiae with activities encoded by ScXYL2 or possibly SOR1 or SOR2, and GRE3 is feasible, but requires efficient redox balance engineering. Compared to D-xylose, D-glucose is a cheap and readily available substrate and thus an attractive alternative for xylitol manufacture. In this study, the pentose phosphate pathway (PPP) of S. cerevisiae was engineered for production of xylitol from D-glucose. Xylitol was formed from D-xylulose 5-phosphate in strains lacking transketolase activity and expressing the gene coding for XDH from P. stipitis. In addition to xylitol, ribitol, D-ribose and D-ribulose were also formed. Deletion of the xylulokinase-encoding gene increased xylitol production, whereas the expression of DOG1 coding for sugar phosphate phosphatase increased ribitol, D-ribose and D-ribulose production. Strains lacking phosphoglucose isomerase (Pgi1p) activity were shown to produce 5 carbon compounds through PPP when DOG1 was overexpressed. Expression of genes encoding glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase of Bacillus subtilis, GapB, or NAD-dependent glutamate dehydrogenase Gdh2p of S. cerevisiae, altered the cellular redox balance and enhanced growth of pgi1 strains on D glucose, but co-expression with DOG1 reduced growth on higher D-glucose concentrations. Strains lacking both transketolase and phosphoglucose isomerase activities tolerated only low D-glucose concentrations, but the yield of 5-carbon sugars and sugar alcohols on D-glucose was about 50% (w/w).

Polttoaine-etanolin valmistaminen uusiutuvasta raaka-aineesta, kuten kasvimateriaalista, on tärkeää fossiilisten raaka-aineiden rajallisuuden ja ilmastonmuutoksen takia. Saccharomyces cerevisiae -leivinhiiva pystyy tuottamaan tehokkaasti etanolia glukoosista, mutta se ei pysty käyttämään kasvimateriaalin viisihiilisiä sokereita, ksyloosia ja arabinoosia, ilman geneettistä muokkausta. Tutkimuksessa havaittiin, että yksi ksyloosi-sokerin käyttöä rajoittava tekijä on ksylulokinaasi-entsyymi. Lisäämällä tämän entsyymin määrää solussa sekä etanolin tuottonopeus että saanto ksyloosista kasvoivat. Lisäksi ksylitoli-sivutuotteen määrä pieneni. Ksyloosia käyttäviin leivinhiivakantoihin on tuotu tämän sokerin käytön mahdollistavat entsyymit ksyloosi reduktaasi (XR) ja ksylitoli dehydrogenaasi (XDH) ksyloosia luontaisesti käyttävästä Pichia stipitis -hiivasta. Tutkimuksessa osoitettiin, että myös leivinhiivasta itsestään löytyvät geenit GRE3 ja ScXYL2, joiden koodaamilla entsyymeillä on vastaavasti XR ja XDH aktiivisuutta, mahdollistavat kasvun ksyloosilla. GRE3 ja ScXYL2 geenien avulla rakennettu leivinhiivakanta ei kuitenkaan ollut yhtä tehokas kuin vastaava P. stipitis -hiivan geenejä ilmentävä kanta, johtuen Gre3- ja P. stipitis -hiivan XR-entsyymien erilaisista kofaktori vaatimuksista. Jotta leivinhiivan omia entsyymejä voitaisiin hyödyntää kantarakennuksessa, olisi ensin löydettävä tehokkaita keinoja ksyloosi-reitin hapetus-pelkistys tasapainon parantamiseen. Ksyloosi-sokeria on perinteisesti käytetty ksylitolin valmistamiseen. Ennen kemiallista prosessia ksyloosi pitää kuitenkin eristää puumateriaalista. Elintarviketeollisuudessa laajalti käytetty glukoosi-sokeri olisi halpa ja helposti saatavilla oleva vaihtoehto ksylitolin raaka-aineeksi. Tutkimuksessa osoitettiin, että leivinhiiva voidaan muokata tuottamaan ksylitolia, ribitolia ja riboosia glukoosista poistamalla joko sen transketolaasi- tai fosfoglukoosi-isomeraasi-aktiivisuutta koodaavat geenit tai molemmat. Näiden viisihiilisten sokerien ja sokerialkoholien määrää ja suhteita voitiin lisäksi muuttaa tuottamalla Dog1-sokerifosfataasi aktiivisuutta, poistamalla ksylulokinaasi aktiivisuus ja erilaisilla hapetus-pelkistystasapainoon vaikuttavilla entsyymeillä.