GDP-L-fucose: synthesis and role in inflammation

GDP-L-fucose: synthesis and role in inflammation The migration of leukocytes from intravascular locations to extravascular sites is essential to the immune responses. The initial attachment of leukocytes to the endothelium and the rolling step of the leukocyte extravasation cascade are mediated by selectins, a family of cell adhesion molecules on cell surfaces. Selectins are able to recognize glycoproteins and glycolipids containing the tetrasaccharide sialyl Lewis x (sLex, Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc). Several glycosyltransferases are involved in the biosynthesis of sLex, fucosyltransferase VII (Fuc-TVII) being the last enzyme to modify the sLex structure. Fuc-TVII transfers L-fucose from GDP-L-fucose to sialylated N-acetyllactosamine. GDP-L-fucose is synthesized in the cytosol via two different metabolic pathways. The major, constitutively active de novo pathway involves conversion of GDP-α-D-mannose to GDP-β-L-fucose. In the alternative salvage pathway, L-fucokinase synthesizes from free fucose L-fucose-1-phosphate, which is further converted to GDP-L-fucose by GDP-L-fucose pyrophosphorylase. GDP-L-fucose is translocated from the cytosol to Golgi for fucosylation via the GDP-fucose transporter. This thesis involved the study of the synthesis of GDP-L-fucose via the salvage pathway: cloning and expression of murine L-fucokinase and GDP-L-fucose pyrophosphorylase. The gene expression levels of these enzymes were found to be relatively high in various tissues; the mRNA levels were highest in brain, ovary and testis. This study also describes molecular cloning of rat fucosyltransferase VII (FUT7) and its expression as a functional enzyme. Gene expression levels of GDP-L-fucose synthesizing enzymes, GDP-fucose transporter and FUT7 were determined in inflamed tissues as well as cancer cells. Our results revealed a clear upregulation of the enzymes involved in the synthesis of GDP-L-fucose via de novo pathway, GDP-fucose transporter and FUT7 in inflamed tissues and in cancer cells. On the contrary, the GDP-L-fucose salvage pathway was found to be irrelevant in inflammation and in tumorigenesis. Furthermore, our results indicated the transcriptional coregulation of Golgi transporters involved in the synthesis of sulfo sLex, i.e. CMP-sialic acid, GDP-fucose and 3 phosphoadenosine 5 -phosphosulfate transporters, in inflammation.

GDP-L-fukoosi: synteesi ja merkitys tulehduksessa Verenkierron mukana kulkeutuvien valkosolujen eli leukosyyttien on päästävä kudokseen tulehduspaikalle. Tämä tapahtuma alkaa leukosyyttien heikolla lyhytaikaisella tarttumisella verisuonen seinämään, mikä johtaa niiden vauhdin hidastumiseen ja kierimiseen verisuonen seinämää pitkin johtaen edelleen tiukempaan sitoutumiseen ja lopulta kulkeutumiseen verisuonen seinämän läpi kudokseen. Leukosyyttien tarttumista ja sitoutumista verisuonen seinämään välittää tietyt adheesiomolekyylit, joista selektiinit ovat vastuussa leukosyyttien löyhästä tarttumisesta verisuonen seinämään. Verisuonen seinämän tai leukosyytin pinnalla ilmentyvät selektiinit tarttuvat spesifisesti sokerivastinrakenteisiinsa, joista eräs tärkeimpiä on sialyl Lewis x-tetrasakkaridi (sLex, Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc). Fukosyylitransferaasi VII on entsyymi, mikä osallistuu sLex:n rakentumiseen solun Golgissa siirtämällä fukoosin aktivoidusta nukleotidisokerista GDP-L-fukoosista sialyloituun N-asetyylilaktosamiiniin. GDP-L-fukoosi voidaan rakentaa solun sytosolissa kahta eri synteesireittiä pitkin. Pääasiallinen de novo-reitti käsittää GDP-L-fukoosin rakentumisen solun GDP-D-mannoosista kahden entsyymin katalysoimien reaktioiden avulla. Vaihtoehtoinen reitti käyttää lähtöaineena solun ulkopuolelta saatua fukoosia, joka muunnetaan GDP-L-fukoosiksi L-fukokinaasin ja GDP-L-fukoosi pyrofosforylaasin katalysoimien reaktioiden kautta. Sytosolissa syntetisoitu GDP-L-fukoosi kuljetetaan Golgiin GDP-fukoositransportterin kautta. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin GDP-L-fukoosin vaihtoehtoista synteesireittiä: kloonattiin hiiren L-fukokinaasi ja GDP-L-fukoosi pyrofosforylaasi sekä tutkittiin näiden geenien ilmentymistä eri kudoksissa. Tässä työssä kloonattiin myös sLex:ä rakentava rotan fukosyylitransferaasi VII. Molempien GDP-L-fukoosin synteesireittien entsyymien, fukosyylitransferaasi VII:n ja GDP-fukoositransportterin ilmentymistä tutkittiin akuutissa tulehduksessa sekä syöpäsoluissa, sillä sLex:llä tiedetään tulehduksen lisäksi olevan merkitystä myös syöpäsolujen tarttumisessa verisuonen seinämään ja etäispesäkkeiden leviämisessä. Tutkimuksessa havaittiin, että L-fukokinaasin ja GDP-L-fukoosipyrofosforylaasin ilmentymisen taso oli suhteellisen korkea useissa hiiren kudoksissa, erityisesti aivoissa, munasarjoissa, kiveksissä ja munuaisessa. Näiden entsyymien geeniekspression taso ei noussut tulehduksessa eikä syöpäsoluissa. Sen sijaan GDP-L-fukoosin de novo-reitin entsyymien, fukosyylitransferaasi VII:n sekä GDP-fukoositransportterin ilmentyminen nousi huomattavasti sekä tulehduksessa että syöpäsoluissa.