Pentitol phosphate dehydrogenases: Discovery, characterization and use in D-arabitol and xylitol production by metabolically engineered Bacillus subtilis

The ultimate goal of this study has been to construct metabolically engineered microbial strains capable of fermenting glucose into pentitols D-arabitol and, especially, xylitol. The path that was chosen to achieve this goal required discovery, isolation and sequencing of at least two pentitol phosphate dehydrogenases of different specificity, followed by cloning and expression of their genes and characterization of recombinant arabitol and xylitol phosphate dehydrogenases. An enzyme of a previously unknown specificity, D-arabitol phosphate dehydrogenase (APDH), was discovered in Enterococcus avium. The enzyme was purified to homogenity from E. avium strain ATCC 33665. SDS/PAGE revealed that the enzyme has a molecular mass of 41 ± 2 kDa, whereas a molecular mass of 160 ± 5 kDa was observed under non-denaturing conditions implying that the APDH may exist as a tetramer with identical subunits. Purified APDH was found to have narrow substrate specificity, converting only D-arabitol 1-phosphate and D-arabitol 5-phosphate into D-xylulose 5-phosphate and D-ribulose 5-phosphate, respectively, in the oxidative reaction. Both NAD+ and NADP+ were accepted as co-factors. Based on the partial protein sequences, the gene encoding APDH was cloned. Homology comparisons place APDH within the medium chain dehydrogenase family. Unlike most members of this family, APDH requires Mn2+ but no Zn2+ for enzymatic activity. The DNA sequence surrounding the gene suggests that it belongs to an operon that also contains several components of phosphotransferase system (PTS). The apparent role of the enzyme is to participate in arabitol catabolism via the arabitol phosphate route similar to the ribitol and xylitol catabolic routes described previously. Xylitol phosphate dehydrogenase (XPDH) was isolated from Lactobacillus rhamnosus strain ATCC 15820. The enzyme was partially sequenced. Amino acid sequences were used to isolate the gene encoding the enzyme. The homology comparisons of the deduced amino acid sequence of L. rhamnosus XPDH revealed several similar enzymes in genomes of various species of Gram-positive bacteria. Two enzymes of Clostridium difficile and an enzyme of Bacillus halodurans were cloned and their substrate specificities together with the substrate specificity of L. rhamnosus XPDH were compared. It was found that one of the XPDH enzymes of C. difficile and the XPDH of L. rhamnosus had the highest selectivity towards D-xylulose 5-phosphate. A known transketolase-deficient and D-ribose-producing mutant of Bacillus subtilis (ATCC 31094) was further modified by disrupting its rpi (D-ribose phosphate isomerase) gene to create D-ribulose- and D-xylulose-producing strain. Expression of APDH of E. avium and XPDH of L. rhamnosus and C. difficile in D-ribulose- and D-xylulose-producing strain of B. subtilis resulted in strains capable of converting D-glucose into D-arabitol and xylitol, respectively. The D-arabitol yield on D-glucose was 38 % (w/w). Xylitol production was accompanied by co-production of ribitol limiting xylitol yield to 23 %.

Ksylitoli on viisihiilinen sokerialkoholi (pentitoli), jota esiintyy luonnossa mm. hedelmissä ja vihanneksissa. Sen makeus on samaa luokkaa kuin sakkaroosin, mutta toisin kuin sakkaroosi, ksylitoli lisää suun ja hampaiden terveyttä ehkäisemällä hampaiden reikiintymistä. Ksylitoli on myös erinomainen makeutusaine diabeetikoille, koska sen metabolia ei riipu insuliinista. Ksylitolia käytetäänkin yleisesti mm. purukumeissa, karkeissa ja hammastahnoissa. Vaihtoehtoisten makeutusaineiden kulutus on viime vuosina kasvanut kovaa vauhtia, joten myös ksylitolin kulutus on ollut reippaassa nousussa. Jos kehitys jatkuu samanlaisena, on hyvin todennäköistä, että vaihtoehtoiset menetelmät ksylitolin tuottamiseksi voivat osoittautua tarpeellisiksi. Perinteinen ksylitolin tuotantomenetelmä perustuu ksyloosin pelkistämiseen kemiallisesti. Ksyloosia taas voidaan erottaa erilaisten kasviperäisten materiaalien hydrolysaateista, ja sitä syntyy mm. selluloosateollisuuden sivutuotteena. Ksyloosin saatavuus on kuitenkin rajallinen sekä sen laatu vaihteleva, mikä hankaloittaa ksylitolin valmistusprosessia. D-Arabitolia voidaan myös käyttää ksylitolituotannon lähtöaineena, mutta D-arabitolilla voisi olla käyttösovellutuksia myös alati kasvavilla vaihtoehtoisten makeuttajien markkinoilla. On todettu, että ihminen ei voi käyttää tai käyttää erittäin heikosti D-arabitolia energianlähteenään, joten näin ollen se olisi erittäin vähäkalorinen makeuttaja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää vaihtoehtoinen, metaboliamuokkaukseen perustuva ksylitolin tuottomenetelmä, joka olisi teollisesti kannattava ja jonka raaka-aineena olisi glukoosi. Lähtöbakteerikannaksi tälle aineenvaihdunnanmuokkaustyölle valittiin tunnettu D-riboosia tuottava Bacillus subtilis kanta, jolta puuttuu transketolaasientsyymin aktiivisuus. Tämän kannan aineenvaihduntaa muokattiin edelleen siten, että sen D-riboosifosfaatti-isomeraasientsyymi inaktivoitiin. Näin saatiin aikaiseksi B. subtilis kanta, joka tuotti D-riboosin sijasta D-ribuloosia ja D-ksyluloosia. Tunnetuin pentitolien kataboliareitti bakteereilla on reitti, jossa pentitoli solun sisään tultuaan hapetetaan vastaavaksi pentuloosiksi. Tämän jälkeen pentuloosi fosforyloidaan, jolloin muodostuu pentuloosifosfaatti, kuten D-ksyluloosi-5-fosfaatti, joka on solun normaalin aineenvaihdunnan välituote. Vaihtoehtoisesti pentitoli voidaan ottaa solun sisään myös fosfotransferaasisysteemin avulla, jolloin pentitoli ensin fosforyloidaan ja sitten hapetetaan pentitolifosfaattidehydrogenaasin avulla pentuloosifosfaatiksi. Tämä reitti ei kuitenkaan ole ollut kovin tunnettu ja se olikin kuvattu aikaisemmin vain muutamilla Lactobacillus kannoilla ja vain ribitolille ja ksylitolille. Tässä tutkimuksessa todettiin, että reitti on huomattavasti yleisempi bakteereilla kuin on aikaisemmin luultu ja näitä pentitolifosfaattidehydrogenaaseja löydettiin useammasta gram-positiivisesta bakteerikannasta sekä entsyymien ominaisuuksia vertailtiin. Samoin tässä tutkimuksessa sekä reitti että sitä katalysoiva pentitolifosfaattidehydrogenaasientsyymi kuvattiin ensimmäistä kertaa myös D-arabitolille. Kun pentitolifosfaattidehydrogenaaseja, D-arabitolifosfaattidehydrogenaasi tai ksylitolifosfaattidehydrogenaasi, ylituotettiin D-ribuloosia ja D-ksyluloosia tuottavassa B. subtilis kannassa, muodostui kantoja jotka tuottivat D-arabitolia tai ksylitolia glukoosista. D-Arabitolin saanto glukoosista oli 38% ja ksylitolin 28%.