Cellular Membranes as a Playground for Semliki Forest Virus Replication Complex

All positive-strand RNA viruses utilize cellular membranes for the assembly of their replication complexes, which results in extensive membrane modification in infected host cells. These alterations act as structural and functional scaffolds for RNA replication, providing protection for the viral double-stranded RNA against host defences. It is known that different positive-strand RNA viruses alter different cellular membranes. However, the origin of the targeted membranes, the mechanisms that direct replication proteins to specific membranes and the steps in the formation of the membrane bound replication complex are not completely understood. Alphaviruses (including Semliki Forest virus, SFV), members of family Togaviridae, replicate their RNA in association with membranes derived from the endosomal and lysosomal compartment, inducing membrane invaginations called spherules. Spherule structures have been shown to be the specific sites for RNA synthesis. Four replication proteins, nsP1-nsP4, are translated as a polyprotein (P1234) which is processed autocatalytically and gives rise to a membrane-bound replication complex. Membrane binding is mediated via nsP1 which possesses an amphipathic α-helix (binding peptide) in the central region of the protein. The aim of this thesis was to characterize the association of the SFV replication complex with cellular membranes and the modification of the membranes during virus infection. Therefore, it was necessary to set up the system for determining which viral components are needed for inducing the spherules. In addition, the targeting of the replication complex, the formation site of the spherules and their intracellular trafficking were studied in detail. The results of current work demonstrate that mutations in the binding peptide region of nsP1 are lethal for virus replication and change the localization of the polyprotein precursor P123. The replication complex is first targeted to the plasma membrane where membrane invaginations, spherules, are induced. Using a specific regulated endocytosis event the spherules are internalized from the plasma membrane in neutral carrier vesicles and transported via an actin-and microtubule-dependent manner to the pericentriolar area. Homotypic fusions and fusions with pre-existing acidic organelles lead to the maturation of previously described cytopathic vacuoles with hundreds of spherules on their limiting membranes. This work provides new insights into the membrane binding mechanism of SFV replication complex and its role in the virus life cycle. Development of plasmid-driven system for studying the formation of the replication complex described in this thesis allows various applications to address different steps in SFV life cycle and virus-host interactions in the future. This trans-replication system could be applied for many different viruses. In addition, the current work brings up new aspects of membranes and cellular components involved in SFV replication leading to further understanding in the formation and dynamics of the membrane-associated replication complex.

Positiivisäikeiset RNA virukset ovat kaikkein suurin virusryhmä, joka sisältää monia merkittäviä taudinaiheuttajia. Näiden virusten perimäaines on RNA:ta, joka voi suoraan soluun päästyään toimia lähetti-RNA:na. Kaikki positiivisäikeiset RNA virukset käyttävät hyväkseen solunsisäisiä kalvorakenteita, joiden yhteyteen ne rakentavat perimän monistamisesta vastaavat replikaatiokompleksinsa. Tämä johtaa infektoitujen solujen kalvorakenteiden laajamittaisiin muutoksiin. Kalvot toimivat virusreplikaation alustoina ja ne myös suojaavat monistamisen kaksisäikeistä RNA-välimuotoa solun puolustusmekanismeilta. Virusten käyttämien kalvojen alkuperä, se millä tavalla replikaatioproteiinit ohjautuvat kalvoille sekä replikaatikompleksin muodostumisen eri vaiheet ovat kuitenkin huonosti tunnettuja. Alfavirukset (mukaan lukien Semliki Forest virus, SFV) monistavat RNA:taan solun endosomien ja lysosomien kalvojen ulkopinnalla ja muodostavat näihin kuroumia, joita kutsutaan sferuleiksi. Juuri sferulit ovat RNA:n replikaation tapahtumapaikkoja. Virusten neljä replikaatioproteiinia (nsP1-nsP4) ohjautuvat kalvolle, joihin tarttumista välittää nsP1 proteiinin keskiosassa sijaitsevan amfifiilisen alfaheliksin välityksellä. Amfifiilisessä rakenteessa toinen puoli helikaalisesta spiraalista on hydrofobinen ja tarttuu kalvoon. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tarkastella, millä kalvomuutokset tapahtuvat SFV-infektion aikana soluissa. Väitöskirjassa osoitetaan, että mutaatiot amfifiilisessä heliksissä johtavat viruksen kyvyttömyyteen lisääntyä. Samat mutaatiot estävät myös replikaatioproteiinien tarttumisen kalvoihin. Toiseksi osoitetaan, että replikaatioproteiinit ohjautuvat ensin solukalvon sisäpinnalle, jossa sferulit muodostuvat. Käyttäen hyväkseen solun endosytoosikoneistoa ja solutukirangan aktiinia ja mikrotubuleita, sferulit siirtyvät kuljetusrakkuloissa tuman läheisyyteen. Siellä ne fuusioituvat solun happamiin endosomeihin ja lysosomeihin. Tämän tuloksena syntyy suuria kalvon ympäröimiä vakuoleja, joiden pinnalla on satoja sferuleita monistamassa viruksen perimäainesta. Kolmanneksi tässä työssä on rakennettu DNA-plasmidien transfektioon perustuva uusi menetelmä, jolla SFV:n replikaatiokompleksit voidaan rakentaa solussa erillisistä proteiini- ja RNA-komponenteista. Tällä menetelmällä tutkitaan replikaatiokompleksin muodostumisen vaiheita. Samanlaista menetelmää voidaan jatkossa soveltaa moniin eri viruksiin. Väitöskirjan perusteella voidaan paremmin ymmärtää viruksen replikaatiokompleksien syntyä ja liikkumista soluissa, mikä antaa jatkossa keinoja estää virusten lisääntymistä.