Stabilization of Phospholipid Coatings in Capillary Electrophoresis

The development of a simple method of coating a semi-permanent phospholipid layer onto a capillary for electrochromatography use was the focus of this study. The work involved finding good coating conditions, stabilizing the phospholipid coating, and examining the effect of adding divalent cations, cetyltrimethylammonium bromide, and polyethylene glycol (PEG)-lipids on the stability of the coating. Since a further purpose was to move toward more biological membrane coatings, the capillaries were also coated with cholesterol-containing liposomes and liposomes of red blood cell ghost lipids. Liposomes were prepared by extrusion, and large unilamellar vesicles with a diameter of about 100 nm were obtained. Zwitterionic phosphatidylcholine (PC) was used as a basic component, mainly 1-palmitoyl-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) but also eggPC and 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC). Different amounts of sphingomyelin, bovine brain phosphatidylserine, and cholesterol were added to the PC. The stability of the coating in 40 mM N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES) solution at pH 7.4 was studied by measuring the electroosmotic flow and by separating neutral steroids, basic proteins, and low-molar-mass drugs. The presence of PC in the coating solution was found to be essential to achieving a coating. The stability of the coating was improved by the addition of negative phosphatidylserine, cholesterol, divalent cations, or PEGylated lipids, and by working in the gel-state region of the phospholipid. Study of the effect on the PC coating of divalent metal ions calcium, magnesium, and zinc showed a molar ratio of 1:3 PC/Ca2+ or PC/Mg2+ to give increased rigidity to the membrane and the best coating stability. The PEGylated lipids used in the study were sterically stabilized commercial lipids with covalently attached PEG chains. The vesicle size generally decreased when PEGylated lipids of higher molar mass were present in the vesicle. The predominance of discoidal micelles over liposomes increased PEG chain length and the average size of the vesicles thus decreased. In the capillary electrophoresis (CE) measurements a highly stable electroosmotic flow was achieved with 20% PEGylated lipid in the POPC coating dispersion, the best results being obtained for disteroyl PEG (3000) conjugates. The results suggest that smaller particles (discoidal micelles) result in tighter packing and better shielding of silanol groups on the silica wall. The effect of temperature on the coating stability was investigated by using DPPC liposomes at temperatures above (45 C) and below (25 C) the main phase transition temperature. Better results were obtained with DPPC in the more rigid gel state than in the fluid state: the electroosmotic flow was heavily suppressed and the PC coating was stabilized. Also dispersions of DPPC with 0−30 mol% of cholesterol and sphingomyelin in different ratios, which more closely resemble natural membranes, resulted in stable coatings. Finally, the CE measurements revealed that a stable coating is formed when capillaries are coated with liposomes of red blood cell ghost lipids.

Alla organismer är uppbyggda av celler som omges av ett cellmembran. Cellmembranen består till en stor del av fosfolipider. Molekylstrukturen är sådan att fosfolipiderna har en hydrofil (vattengillande) del och en lipofil (fettgillande) del. I vattenlösningar associerar fosfolipiderna spontant och bildar bilager så att den hydrofila delen är vänd utåt mot vattnet och den lipofila delen inåt. Då bilagret sluter sig till ett klot bildas en liposom. Liposomerna används bland annat för att transportera läkemedel i kroppen. Lipsomerna används också inom forskningen som en modell för cellmembran. I det här arbetet användes liposomer för att belägga silikakapillärer, tunna glasrör. Kapillärerna används i kapillärelektrofores (CE) för att separera analyter i ett elfält. Avsikten var att utveckla en stabil biologisk beläggning genom att skölja kapillären med liposomlösningen. Beläggningen kan användas för att studera analyt-membranväxelverkningar. En relativt enkel metod utvecklades för att ytbelägga CE-kapillärer med fosfolipider. Studiens tyngdpunkt var att stabilisera fosfolipidytorna, d.v.s. att hitta bra beläggningsförhållanden, optimera fosfolipidsammansättningen och undersöka hur tillsats av tvåvärda katjoner, ytaktiva ämnen, kolesterol eller polyetylenglykol (PEG) -lipider inverkar på beläggningens stabilitet. Målet var att gå mot naturligare membranbeläggningar. Liposomerna, med en diameter på ca 100 nm, är stora unilamellara vesikler som förbereds genom extrudering. Beläggningslösningen innehöll zwitterjoniska fosfatidylkolin (PC) som bas med olika mängd sfingomyelin, fosfatidylserin (PS) eller kolesterol. Fosfolipidbeläggningen möjliggjorde separation av neutrala steroider och basiska proteiner. Beläggningens stabilitet undersöktes genom att mäta det elektroosmotiska flödet. För att åstadkomma en stabil beläggning behövdes PC som baskomponent i beläggningslösningen. Beläggningens stabilitet förbättrades då PS, kolesterol, tvåvärda katjoner eller PEGylerade lipider fanns i beläggningslösningen eller då fosfolipiderna var i geltillstånd. Slutligen visade CE undersökningarna att stabila beläggningar åstadkoms med lipider extraherade ur röda blodkroppar.

Kaikki organismit koostuvat soluista, joita ympäröi solukalvo. Solukalvo koostuu pääasiassa fosfolipideistä, joissa on hydrofiilinen (vettä suosiva) ja hydrofobinen (vettä hylkivä) osa. Vesiliuoksissa fosfolipidit muodostavat spontaanisti kaksoiskalvon, jossa hydrofiilinen osa on kääntynyt ulospäin kohti vettä ja hydrofiilinen osa sisäänpäin. Liposomi muodostuu, kun kaksoiskalvo sulkeutuu palloksi. Liposomeja käytetään muun muassa lääkeaineiden kuljettamiseen kehossa ja tutkimuksessa solukalvon mallisysteemeinä. Tässä työssä liposomeja käytettiin silikakapillaarin, ohuen lasiputken, sisäpinnan päällystämiseen. Tekniikkaa, jolla analyyttejä voidaan erottaa toisistaan sähkökentän avulla, kutsutaan kapillaarielektroforeesiksi (CE). Työn tarkoituksena oli kehittää pysyvä biologinen membraanipäällystys, jotta voitiin tutkia analyytti-membraanivuorovaikutuksia kapillarielektroforeesissa. Työssä kehitettiin nopea menetelmä, jolla kapillaareja päällystettiin fosfolipideillä. Työssä keskityttiin erityisesti fosfolipidipinnan stabiloimiseen sekä päällystysolosuhteiden ja fosfolipidiliuoksen koostumuksen optimoimiseen. Työssä tutkittiin myös, miten kahdenarvoisten kationien, pinta-aktiivisten aineiden, kolesterolin tai polyetyleeniglykoli (PEG) -lipidien lisääminen fosfolipidiliuokseen vaikuttaa päällystyksen pysyvyyteen. Tarkoituksena oli siirtyä kohti luonnollisia membraanipintoja. Liposomit, joiden halkaisija on noin 100 nm, ovat isoja yksikalvoisia vesikkeleitä, ja niitä valmistetaan ekstruudaamalla. Päällystysliuos koostui fosfatidyylikoliinista (PC), ja se sisälsi eri pitoisuuksia sfingomyeliiniä, fosfatidyyliseriiniä ja kolesterolia. Fosfolipidipäällystyksen ansiosta kapillaarielektroforeesilla voitiin erottaa neutraaleja steroideja ja kationisia proteiineja. Päällystyksen stabiilisuus määritettiin mittaamalla elektro-osmoottisen virtauksen toistettavuutta. Tutkimuksessa todettiin, että PC:n läsnäolo päällystysliuoksessa on välttämätön stabiilin päällystyksen aikaansaamiseksi. Päällystyksen stabiilisuus paranee lisäämällä fosfatidyyliseriiniä, kolesterolia, kahdenarvoisia kationeja ja PEG-lipidejä sekä työskentelemällä geelimuotoisilla fosfolipideillä. Lisäksi CE-mittaukset osoittivat, että punasoluista eristetyillä lipideillä saadaan aikaiseksi pysyvä päällystys kapillaarissa.