Aspects and Applications of Pulse Sequence Design for Solution-State Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

NMR spectroscopy enables the study of biomolecules from peptides and carbohydrates to proteins at atomic resolution. The technique uniquely allows for structure determination of molecules in solution-state. It also gives insights into dynamics and intermolecular interactions important for determining biological function. Detailed molecular information is entangled in the nuclear spin states. The information can be extracted by pulse sequences designed to measure the desired molecular parameters. Advancement of pulse sequence methodology therefore plays a key role in the development of biomolecular NMR spectroscopy. A range of novel pulse sequences for solution-state NMR spectroscopy are presented in this thesis. The pulse sequences are described in relation to the molecular information they provide. The pulse sequence experiments represent several advances in NMR spectroscopy with particular emphasis on applications for proteins. Some of the novel methods are focusing on methyl-containing amino acids which are pivotal for structure determination. Methyl-specific assignment schemes are introduced for increasing the size range of 13C,15N labeled proteins amenable to structure determination without resolving to more elaborate labeling schemes. Furthermore, cost-effective means are presented for monitoring amide and methyl correlations simultaneously. Residual dipolar couplings can be applied for structure refinement as well as for studying dynamics. Accurate methods for measuring residual dipolar couplings in small proteins are devised along with special techniques applicable when proteins require high pH or high temperature solvent conditions. Finally, a new technique is demonstrated to diminish strong-coupling induced artifacts in HMBC, a routine experiment for establishing long-range correlations in unlabeled molecules. The presented experiments facilitate structural studies of biomolecules by NMR spectroscopy.

Liuostila NMR-spektroskopian pulssisarjojen suunnittelu: Ominaisuuksia ja sovellutuksia Proteiinit ovat solujen työjuhtia. Proteiinit osallistuvat esimerkiksi molekyylien kuljetukseen ja kemiallisten reaktioiden katalyysiin. Proteiinin rakenne kertoo, mikä on sen funktio. Tätä tietoa voidaan käyttää solujen sisäisen toiminnan ymmärtämiseen ja soveltaa uusien lääkeaineiden kehittämiseen. Proteiinit ovat liian pieniä havaittavaksi edes parhaalla mahdollisella mikroskoopilla. Proteiinien kolmiulotteinen rakenne voidaan kuitenkin määrittää atomitasolla ydinmagneettisen resonanssin (NMR) avulla. NMR tekniikka perustuu samaan periaatteeseen, jota käytetään aivojen magneettikuvantamisessa sairaaloissa, mutta proteiinien pienen koon takia laitteelta vaaditaan huomattavasti voimakkaampaa magneettikenttää. Kun proteiini laitetaan koeputkessa magneettikentään, proteiinien atomit alkavat käyttäytyä pienten antennien tavoin. Samalla tavalla kuin radioaaltoja vastaanottavat laitteet tunnistavat tiettyjä taajuuksia, proteiinit absorboivat vain rakenteeseensa sopivaa säteilyä. Tällä tavalla voidaan kustakin atomista syntyvät signaalit tunnistaa ja lopulta proteiinin koko rakenne määrittää. NMR:n avulla voidaan tutkia myös proteiinin muita ominaisuuksia kuten sen dynamiikkaa ja sen vuorovaikutuksia muiden molekyylien kanssa. Proteiineissa on kuitenkin paljon atomeja ja tästä johtuen myös niiden spektreissä on paljon signaaleja, jotka ovat usein päällekkäin. Näinollen signaalien alkuperän määrittäminen on vaikeaa. Useita radiopulsseja voi yhdistää pulssisarjaksi, joka on verrattavissa nuotteihin. Pulssisarjojen avulla on mahdollista tuottaa sellaisia spektrejä, joissa yksittäiset signaalit ovat erillään ja tunnistettavissa. Jo pari kymmentä vuotta pienten proteiinien rakenteen määrittäminen on ollut mahdollista NMR:n avulla. Suurempien molekyylien kolmiulotteisen rakenteen määrittäminen on kuitenkin edelleen haastavaa. Tässä suhteessa uusien pulssisarjojen kehittäminen on erityisen tärkeää sillä niiden avulla spektrien sisältämä tieto on helpommin tulkittavissa, sisältää enemmän yksityiskohtia ja lisäksi itse spektrien tuottaminen on tehokkaampaa. Tämä väitöstyö käsittelee ydinmagneettisen resonanssin menetelmien kehittämistä ja niiden soveltamista biomolekyylien rakenteen selvittämiseen. Työ mahdollistaa yhä kookkaampien proteiinien rakenteiden määrittämisen ja parantaa käytössäolevien menetelmien ominaisuuksia. Väitöskirja tarkastetaan perjantaina 7. marraskuuta 2008 klo 12 Viikin Biokeskus 2:ssa.