Autoxidation of conjugated linoleic acid methyl ester in the presence of α-tocopherol: the hydroperoxide pathway

The autoxidation of conjugated linoleic acid (CLA) is poorly understood in spite of increasing interest in the beneficial biological properties of CLA and growing consumption of CLA-rich foods. In this thesis, the autoxidation reactions of the two major CLA isomers, 9-cis,11-trans-octadecadienoic acid and 10-trans,12-cis-octadecadienoic acid, are investigated. The results contribute to an understanding of the early stages of the autoxidation of CLA methyl ester, and provide for the first time a means of producing and separating intact CLA methyl ester hydroperoxides as well as basic knowledge on lipid hydroperoxides and their hydroxy derivatives. Conjugated diene allylic monohydroperoxides were discovered as primary autoxidation products formed during autoxidation of CLA methyl esters in the presence and absence of α-tocopherol. This established that one of the autoxidation pathways of CLA methyl ester is the hydroperoxide pathway. Hydroperoxides were produced from the two major CLA methyl esters by taking advantage of the effect of α-tocopherol to promote hydroperoxide formation. The hydroperoxides were analysed and separated first as methyl hydroxyoctadecadienoates and then as intact hydroperoxides by HPLC. The isolated products were characterized by UV, GC-MS, and NMR techniques. In the presence of a high amount of α-tocopherol, the autoxidation of CLA methyl ester yields six kinetically-controlled conjugated diene monohydroperoxides and is diastereoselective in favour of one particular geometric isomer as a pair of enantiomers. The primary autoxidation products produced from the two major CLA isomers include new positional isomers of conjugated diene monohydroperoxides, the 8-, 10-, 12-, and 14-hydroperoxyoctadecadienoates. Furthermore, two of these new positional isomers have an unusual structure for a cis,trans lipid hydroperoxide where the allylic methine carbon is adjacent to the cis instead of the usual trans double bond. The 1H and 13C NMR spectra of nine isomeric methyl hydroxyoctadecadienoates and of ten isomeric methyl hydroperoxyoctadecadienoates including the unusual cis,trans hydroperoxides, i.e. Me 8-OOH-9c,11t and Me 14-OOH-10t,12c, were fully assigned with the aid of 2D NMR spectroscopy. The assigned NMR data enabled determination of the effects of the hydroxyl and hydroperoxyl groups on the carbon chemical shifts of CLA isomers, identification of diagnostic signals, and determination of chemical shift differences of the olefinic resonances that may help with the assignment of structure to as yet unknown lipid hydroperoxides either as hydroxy derivatives or as intact hydroperoxides. A mechanism for the hydroperoxide pathway of CLA autoxidation in the presence of a high amount of α-tocopherol was proposed based on the characterized primary products, their relative distribution, and theoretical calculations. This is an important step forward in CLA research, where exact mechanisms for the autoxidation of CLA have not been presented before. Knowledge of these hydroperoxide formation steps is of crucial importance for understanding the subsequent steps and the different pathways of the autoxidation of CLA. Moreover, a deeper understanding of the autoxidation mechanisms is required for ensuring the safety of CLA-rich foods. Knowledge of CLA oxidation and how it differs from the oxidation of nonconjugated polyunsaturated fatty acids may also be the key to understanding the biological mechanisms of CLA activity.

Konjugoitu linolihappo (CLA) on yleisnimitys joukolle oktadekadieenihapon isomeerejä, joita löytyy märehtijöiden maidon ja lihan rasvoista. CLA on herättänyt laajaa tieteellistä kiinnostusta mahdollisten terveysvaikutustensa takia. CLA on mm. ainoa rasvahappo, jolla on todettu olevan syöpää ehkäiseviä vaikutuksia. Rasvojen hapettumisen tiedetään heikentävän elintarvikkeiden laatua ja turvallisuutta. Huolimatta tieteellisestä kiinnostuksesta ja CLA:lla rikastettujen elintarvikkeiden ja ravintolisien kasvaneesta kulutuksesta, CLA:n hapettuminen tunnetaan huonosti. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin CLA:n biologisesti vaikuttavien pääisomeerien, rumeenihapon ja konjueenihapon, hapettumista ilman hapella (auto-oksidaatio). Tutkimustyön tulokset valottavat CLA:n hapettumisen huonosti tunnettua alkuvaihetta, ja ne antavat kemiallista perustietoa syntyneistä hydroperoksideista ja niiden hydroksijohdannaisista sekä ensimmäistä kertaa menetelmän CLA:n hydroperoksidien tuottamiseen ja erottamiseen. Tutkimuksessa CLA:n ensimmäisen vaiheen hapettumistuotteiksi löydettiin konjugoidut monohydroperoksidit. Tämä varmisti sen, että CLA hapettuu ainakin osittain kuten kertatyydyttymättömät ja ei-konjugoidut monityydyttymättömät rasvahapot. Hydroperoksideja tuotettiin CLA:sta hyödyntämällä α-tokoferolin (E-vitamiinin pääkomponentti) hydroperoksideja stabiloivaa vaikutusta. Hydroperoksidit eristettiin ja erotettiin sekä hydroperoksideina että näiden hydroksijohdannaisina nestekromatografisin menetelmin. Puhtaat yksittäiset tuotteet karakterisoitiin spektroskopisilla menetelmillä. α-Tokoferolin läsnä ollessa CLA:n hapetus tuotti kuusi konjugoitua monohydroperoksidia, joista yhtä isomeeriä syntyi ylimäärin. Osa tuotetuista hydroperoksideista on aikaisemmin tuntemattomia paikkaisomeerejä. Erityisen kiinnostavaa on se, että kaksi näistä uusista paikkaisomeereistä on geometrialtaan epätavallisia cis,trans-hydroperoksideja, joissa cis-kaksoissidos on hydroperoksiryhmän viereisessä hiilessä poiketen tavallisista rasvahappojen hydroperoksideista, joissa kyseisellä kaksoissidoksella on aina trans-geometria. Rasvahappojen hydroperoksidien NMR-spektrien resonanssien analysointi on harvinaista johtuen niiden epästabiilisudesta. Tässä työssä onnistuttiin analysoimaan kymmenen hydroperoksidin ja yhdeksän hydroksijohdannaisen NMR-spektrien resonanssit. Tämä mahdollisti sen, että sekä hydroperoksi- että hydroksiryhmien vaikutus CLA:n 13C-resonansseihin voitiin laskea, diagnostiset signaalit tunnistaa ja olefiinisten hiilten resonanssierot määrittää. Näitä tietoja voidaan hyödyntää tuntemattomien lipidihydroperoksidien tai niiden hydroksijohdannaisten karakterisoinnissa. Väitöskirjatyössä CLA:n hydroperoksidien muodostumisreitille pystyttiin esittämään mekanismi karakterisoitujen hydroperoksidien, niiden isomeerijakauman, ja teoreettisten laskujen perusteella. Tämä on merkittävä askel eteenpäin CLA:n tutkimuksessa, jossa yksityiskohtaisia hapetusmekanismeja ei ole aiemmin esitetty. Tämän mekanismin avulla voidaan ennustaa syntyvät hydroperoksidit muista CLA-isomeereistä ja se toimii perustana mekanismin yksityiskohtien täydelliselle selvittämiselle. Tieto hydroperoksidien muodostumisesta on tärkeä, jotta CLA:n hapettumisen jatkoreaktiot ja hapettumisreitit voitaisiin ymmärtää paremmin. Tämä yksityiskohtainen hapetusmekanismin tunteminen on välttämätöntä, jotta CLA:n hapettuminen terveysvaikutteisissa elintarvikkeissa tai ravintolisissä voidaan estää ja näin taata näiden tuotteiden turvallisuus. Lisäksi, on mahdollista, että CLA:n hapettuminen on yhteydessä CLA:n biologisiin vaikutuksiin.