Weakening of the Gram-negative bacterial outer membrane - A tool for increasing microbiological safety

Gram-negative bacteria are harmful in various surroundings. In the food industy their metabolites are potential cause of spoilage and this group also includes many severe or potential pathogens, such as Salmonella. Due to their ability to produce biofilms Gram-negative bacteria also cause problems in many industrial processes as well as in clinical surroundings. Control of Gram-negative bacteria is hampered by the outer membrane (OM) in the outermost layer of the cells. This layer is an intrinsic barrier for many hydrophobic agents and macromolecules. Permeabilizers are compounds that weaken OM and can thus increase the activity of antimicrobials by facililating entry of hydrophobic compounds and macromolecules into the cell where they can reach their target sites and inhibit or destroy cellular functions. The work described in this thesis shows that lactic acid acts as a permeabilizer and destabilizes the OM of Gram-negative bacteria. In addition, organic acids present in berriers, i.e. malic, sorbic and benzoic acid, were shown to weaken the OM of Gram-negative bacteria. Organic acids can poteniate the antimicrobial activity of other compounds. Microbial colonic degradation products of plant-derived phenolic compounds (3,4-dihydroxyphenylacetic acid, 3-hydroxyphenylacetic acid, 3,4-dihydroxyphenylpropionic acid, 4-hydroxyphenylpropionic acid, 3-phenylpropionic acid and 3-hydroxyphenylpropionic acid) efficiently destabilized OM of Salmonella. The studies increase our understanding of the mechanism of action of the classical chelator, ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA). In addition, the results indicate that the biocidic activity of benzalkonium chloride against Pseudomonas can be increased by combined use with polyethylenimine (PEI). In addition to PEI, several other potential permeabilizers, such as succimer, were shown to destabilize the OM of Gram-negative bacteria. Furthermore, combination of the results obtained from various permeability assays (e.g. uptake of a hydrophobic probe, sensitization to hydrophobic antibiotics and detergents, release of lipopolysaccharide (LPS) and LPS-specific fatty acids) with atomic force microscopy (AFM) image results increases our knowledge of the action of permeabilizers.

Gram-negatiivisten bakteerien ryhmään kuuluu laaja joukko haittamikrobeja, esimerkiksi potentiaalisia patogeeneja (kuten salmonella) ja elintarvikkeissa esiintyviä pilaajamikrobeja. Monille Gram-negatiivisille bakteereille on ominaista kyky kasvaa pinnoilla ja muodostaa biofilmiä, minkä vuoksi ne aiheuttavat ongelmia teollisuudessa sekä kliinisissä ympäristöissä. Gram-negatiivisille bakteereille ominainen ulkokalvorakenne heikentää monien antimikrobisten yhdisteiden kulkeutumista solun sisään, minkä vuoksi Gram-negatiivisten bakteereiden kasvun estäminen on hankalaa. Permeabilisaattorit ovat yhdisteitä, jotka kykenevät vaurioittamaan Gram-negatiivisten bakteereiden ulkokalvorakennetta ja mahdollistavat hydrofobisten yhdisteiden, kuten antibioottien ja desinfektioaineiden, kulkeutumisen solun sisään, jossa ne pääsevät reagoimaan vaikutuskohteidensa kanssa. Tässä työssä osoitettiin, että maitohappo ja lukuisat muut orgaaniset hapot (kuten bentsoe-, omena- ja sorbiinihappo, joita luontaisesti esiintyy marjoissa) heikensivät Gram-negatiivisten bakteerien ulkokalvoa. Orgaaniset hapot voivat tehostaa antimikrobisten yhdisteiden vaikutuksia. Suolistossa marjojen sisältämistä fenoliyhdisteistä muodostuvien mikrobien metaboliatuotteiden (fenyylipropioni- ja etikkahappojohdannaisia) osoitettiin heikentävän salmonellan ulkokalvoa ja herkistävän ne hydrofobisille antibiooteille. Lisäksi työssä selkiytettiin klassisen permeabilisaattorin, EDTA-kelaattorin, vaikutusmekanismeja salmonellaa kohtaan. Yhdistämällä useita permeabilisaattoriominaisuuksia mittaavia menetelmiä ja atomivoimamikroskopian antamat tulokset havaittiin, että polyetyleeni-imiini voimakkaasti vaurioitti Pseudomonas-bakteerien ulkokalvoa ja herkisti solut kvaternaariselle bentsalkoniumkloridi-biosidille. Yhdistämällä permeabilisaattoreiden käyttö antimikrobisiin yhdisteisiin voidaan laajentaa antimikrobisten yhdisteiden vaikutuksia Gram-negatiivisiin bakteereihin. Orgaanisten happojen salmonellan ulkokalvoa heikentävä vaikutus selittää osittain esimerkiksi maitohappobakteerien luontaisen kyvyn estää näiden haittamikrobien kasvua.