DNA-based detection and characterisation of strictly anaerobic beer-spoilage bacteria

Megasphaera cerevisiae, Pectinatus cerevisiiphilus, Pectinatus frisingensis, Selenomonas lacticifex, Zymophilus paucivorans and Zymophilus raffinosivorans are strictly anaerobic Gram-stain-negative bacteria that are able to spoil beer by producing off-flavours and turbidity. They have only been isolated from the beer production chain. The species are phylogenetically affiliated to the Sporomusa sub-branch in the class "Clostridia". Routine cultivation methods for detection of strictly anaerobic bacteria in breweries are time-consuming and do not allow species identification. The main aim of this study was to utilise DNA-based techniques in order to improve detection and identification of the Sporomusa sub-branch beer-spoilage bacteria and to increase understanding of their biodiversity, evolution and natural sources. Practical PCR-based assays were developed for monitoring of M. cerevisiae, Pectinatus species and the group of Sporomusa sub-branch beer spoilers throughout the beer production process. The developed assays reliably differentiated the target bacteria from other brewery-related microbes. The contaminant detection in process samples (10 1,000 cfu/ml) could be accomplished in 2 8 h. Low levels of viable cells in finished beer (≤10 cfu/100 ml) were usually detected after 1 3 d culture enrichment. Time saving compared to cultivation methods was up to 6 d. Based on a polyphasic approach, this study revealed the existence of three new anaerobic spoilage species in the beer production chain, i.e. Megasphaera paucivorans, Megasphaera sueciensis and Pectinatus haikarae. The description of these species enabled establishment of phenotypic and DNA-based methods for their detection and identification. The 16S rRNA gene based phylogenetic analysis of the Sporomusa sub-branch showed that the genus Selenomonas originates from several ancestors and will require reclassification. Moreover, Z. paucivorans and Z. raffinosivorans were found to be in fact members of the genus Propionispira. This relationship implies that they were carried to breweries along with plant material. The brewery-related Megasphaera species formed a distinct sub-group that did not include any sequences from other sources, suggesting that M. cerevisiae, M. paucivorans and M. sueciensis may be uniquely adapted to the brewery ecosystem. M. cerevisiae was also shown to exhibit remarkable resistance against many brewery-related stress conditions. This may partly explain why it is a brewery contaminant. This study showed that DNA-based techniques provide useful tools for obtaining more rapid and specific information about the presence and identity of the strictly anaerobic spoilage bacteria in the beer production chain than is possible using cultivation methods. This should ensure financial benefits to the industry and better product quality to customers. In addition, DNA-based analyses provided new insight into the biodiversity as well as natural sources and relations of the Sporomusa sub-branch bacteria. The data can be exploited for taxonomic classification of these bacteria and for surveillance and control of contaminations.

Megasphaera cerevisiae, Pectinatus cerevisiiphilus, Pectinatus frisingensis, Selenomonas lacticifex, Zymophilus paucivorans ja Zymophilus raffinosivorans ovat ehdottoman anaerobeja (happiherkkiä) oluen pilaajabakteereita. Ne aiheuttavat oluessa samennusta sekä haju- ja makuvirheitä. Lajit kuuluvat firmikuuttien pääjaksossa ns. Sporomusa-alahaaraan. Niitä on toistaiseksi tavattu vain oluen tuotantoketjusta. Näiden bakteerien monitorointi panimonäytteistä perinteisin viljelymenetelmin on hidasta eikä sillä saada tarkkaa lajitunnistusta. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli parantaa Sporomusa-alahaaran oluenpilaajien osoittamista ja tunnistamista sekä tuoda uutta tietoa niiden monimuotoisuudesta, sukulaisuussuhteista ja lähteistä DNA-pohjaisia tekniikoita hyödyntämällä. Tutkimuksessa kehitettiin tiettyjen geenialueiden monistamiseen perustuvat helppokäyttöiset testit M. cerevisiae-lajille, Pectinatus-suvulle sekä Sporomusa-alahaaran pilaajabakteeriryhmälle. Uudet testit mahdollistivat kontaminaation (10 1000 pmy/ml) havaitsemisen prosessinäytteistä 2 8 h:ssa. Lisäksi osoitus oli spesifinen. Valmiista oluesta muutama elinkykyinen solu (≤10 pmy/100 ml) voitiin todeta yleensä 1-3 vrk rikastuskasvatuksen jälkeen. Saavutettu ajansäästö viljelymenetelmään verrattuna oli jopa 6 vrk. Uudet menetelmät mahdollistavat entistä nopeamman reagoinnin ongelmatilanteisiin sekä korjaavien toimenpiteiden kohdentamisen entistä tarkemmin. Tutkimuksessa kuvattiin lisäksi kolme uutta anaerobista oluenpilaajalajia: Megasphaera paucivorans, Megasphaera sueciensis ja Pectinatus haikarae. Niiden tunnistamiseksi löydettiin sekä DNA:n että fenotyyppisten tuntomerkkien analysointiin perustuvat menetelmät. Sporomusa-alahaaran 16S rRNA geenisekvenssien vertailuun perustunut fylogeneettinen analyysi osoitti Selenomonas-suvun olevan polyfyleettinen ja vaativan tulevaisuudessa uudelleenluokittelua. Lisäksi se osoitti, että Zymophilus-lajit kuuluvat itse asiassa Propionispira-sukuun. Tämä sukulaisuussuhde viittaa ensi kertaa näiden bakteerien kasvialkuperään. Olutta pilaavien Megasphaera-lajien ryhmittyminen erilleen muista lähteistä löydettyjen bakteerien sekvensseistä viittasi siihen, että ne ovat sopeutuneet elämään vain panimoympäristössä. Lisäksi tutkimuksessa havaittiin, että M. cerevisiae kykenee kestämään erilaisia panimoprosessin stressiolosuhteita erittäin hyvin. Tulos selittänee osittain, miksi laji on panimokontaminantti. Tutkimuksen tulokset osoittivat, että DNA-pohjaiset tekniikat tarjoavat hyödyllisiä työkaluja, joiden avulla on mahdollista osoittaa ja tunnistaa happiherkät pilaajabakteerit oluen tuotantoketjusta entistä nopeammin ja täsmällisemmin. Tämä auttaa vähentämään kontaminaatioista johtuvia teollisuuden tappioita sekä takaamaan kuluttajalle paremman tuotelaadun. Lisäksi Sporomusa-alahaaran pilaajabakteerien DNA-pohjainen karakterisointi toi uutta tietoa niiden monimuotoisuudesta, sukulaisuussuhteista sekä ekologiasta, jota voidaan hyödyntää näiden organismien luokittelussa sekä kontaminaatioiden hallinnassa ja valvonnassa.