Foodborne Yersinia : Identification and Molecular Epidemiology of Isolates from Human Infections

Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis are among the major enteropathogenic bacteria causing infections in humans in many industrialized countries. In Finland, Y. pseudotuberculosis has caused 10 outbreaks among humans during 1997-2008. Some of these outbreaks have been very extensive involving over 400 cases; mainly children attending schools and day-care. Y. enterocolitica, on the contrary, has caused mainly a large number of sporadic human infections in Finland. Y. pseudotuberculosis is widespread in nature, causing infections in a variety of domestic and wild animals. Foodborne transmission of human infections has long been suspected, however, attempts to trace the pathogen have been unsuccessful before this study that epidemiologically linked Y. pseudotuberculosis to a specific food item. Furthermore, due to modern food distribution systems, foodborne outbreaks usually involve many geographically separate infection clusters difficult to identify as part of the same outbreak. Among pathogenic Y. enterocolitica, the global predominance of one genetically homogeneous type (bioserotype 4/O:3) is a challenge to the development of genetic typing methods discriminatory enough for epidemiological purposes, for example, for tracing back to the sources of infections. Furthermore, the diagnostics of Y. enterocolitica infections is hampered because clinical laboratories easily misidentify some other members of the Yersinia species (Y. enterocolitica–like species) as Y. enterocolitica. This results in misleading information on the prevalence and clinical significance of various Yersinia isolates. The aim of this study was to develop and optimize molecular typing methods to be used in epidemiological investigations of Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis, particularly in active surveillance and outbreak investigations of Y. pseudotuberculosis isolates. The aim was also to develop a simplified set of phenotypic tests that could be used in routine diagnostic laboratories for the correct identification of Y. enterocolitica and Y. enterocolitica –like species. A PFGE method designed here for typing of Y. pseudotuberculosis was efficient in linking the geographically dispersed and apparently unrelated Y. pseudotuberculosis infections as parts of the same outbreak. It proved to be useful in active laboratory-based surveillance of Y. pseudotuberculosis outbreaks. Throughout the study period, information about the diversity of genotypes among outbreak and non-outbreak related strains of human origin was obtained. Also, to our knowledge, this was the first study to epidemiologically link a Y. pseudotuberculosis outbreak of human illnesses to a specific food item, iceberg lettuce. A novel epidemiological typing method based on the use of a repeated genomic region (YeO:3RS) as a probe was developed for the detection and differentiation between strains of Y. enterocolitica subspecies palearctica. This method was able to increase the discrimination in a set of 106 previously PFGE typed Finnish Y. enterocolitica bioserotype 4/O:3 strains among which two main PFGE genotypes had prevailed. The developed simplified method was a more reliable tool than the commercially available biochemical test kits for differentiation between Y. enterocolitica and Y. enterocolitica –like species. In Finland, the methods developed for Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis have been used to improve the identification protocols and in subsequent outbreak investigations.

Y. enterocolitica ja Y. pseudotuberculosis ovat merkittäviä elintarvikevälitteisiä suolistoperäisiä taudinaiheuttajia sekä Suomessa että muissa teollistuneissa maissa. Suomessa on vuosien 1997 -2008 aikana todettu 10 pääasiassa kouluruokailuun liittynyttä Y. pseudotuberculosis epidemiaa. Laajamittaisimmissa epidemioissa on sairastunut kerralla yli 400 henkilöä, valtaosa koululaisia tai päiväkotilapsia. Y. enterocolitica aiheuttaa Suomessa lähinnä yksittäisiä infektioita, joita kuitenkin vuositasolla esiintyy enemmän kuin Y. pseudotuberculosis – infektioita. Bakteerit aiheuttavat suolistotulehduksen jonka oireina esiintyy kuumetta, vatsakipuja ja ripulia. Vatsakipu voi muistuttaa umpilisäkkeen tulehdusta ja johtaa aiheettomaan leikkaukseen. Infektion sairastamisen jälkitautina voi esiintyä reaktiivista niveltulehdusta ja iho-oireista kyhmyruusua. Y. pseudotuberculosis on yleinen ympäristössä ja sen lähteenä toimivat monet eläimet, etenkin jyrsijät, peurat, jänikset ja linnut. Tartunta saadaan usein saastuneen elintarvikkeen tai veden välityksellä. Bakteerin alkuperää ei kuitenkaan ennen tätä tutkimusta ole pystytty jäljittämään epidemiologisen tutkimuksen avulla tiettyyn elintarvikkeeseen. Nykyaikaiset elintarvikkeiden jakeluketjut asettavat lisäksi haasteita elintarvike-epidemioiden selvitystyölle; epidemiat koostuvat usein pienistä, maantieteellisesti hajanaisista tautikeskittymistä, jotka on vaikea havaita osaksi samaa epidemiaa. Maailmanlaajuisesti levinnein muoto Y. enterocolitica -bakteerista (bioserotyyppi 4/O:3) on perimältään hyvin yhdenmukainen. Tämä asettaa haasteita riittävän erottelukykyisen genotyypitysmenetelmän löytämiseksi kyseisen bakteerin tartuntareittien selvittelyyn. Lisäksi Y. enterocolitican erottaminen muista sen kaltaisista Yersinia-suvun bakteereista on usein vaikeaa kliinistä diagnostiikkaa tekevissä laboratorioissa. Virheelliset tunnistukset vääristävät tietoja Y. enterocolitican ja sen kaltaisten bakteerien esiintyvyydestä ja vaikeuttavat bakteerien kliinisen merkitsevyyden arvioimista. Tässä tutkimuksessa kehitettiin molekyylibiologisia tyypitysmenetelmiä Y. enterocolitica ja Y. pseudotuberculosis – bakteerien tartuntareittien jäljitykseen. Kehitetyistä menetelmistä PFGE genotyypitysmenetelmää sovellettiin käytäntöön tutkimuksen aikana ja myös sen jälkeen esiintyneiden Y. pseudotuberculosis epidemioiden selvityksessä. Menetelmä todettiin tehokkaaksi laboratoriopohjaisen epidemiaseurannan apuvälineeksi, jonka avulla tunnistettiin maantieteellisesti hajanaiset tautikeskittymät osaksi samaa epidemiaa. Monitahoisten epidemiologisten tutkimusten avulla pystyttiin ensimmäistä kertaa tunnistamaan Y. pseudotuberculosis epidemiaa välittänyt elintarvike, jäävuorisalaatti. Tutkimusjakson aikana kerättiin myös tietoa genotyyppien jakautumisesta epidemioihin liittyvien ja epidemioiden ulkopuolisten kantojen osalta. Y. enterocolitica subspecies palearctica – bakteerille kehitettiin uusi epidemiologinen tyypitysmenetelmä, joka perustuu alalajille tyypillisen toistuvan sekvenssin (YeO:3RS) käyttöön tunnistimena tyypityksessä. Tämä menetelmä lisäsi PFGE menetelmän erottelukykyä, kun sen avulla tyypitettiin 106 aikaisemmin PFGE-tyypitettyä suomalaista bioserotyypin 4/O:3 kantaa. Työssä kehitettiin lisäksi monia kaupallisia biokemiallisia tunnistustestisarjoja luotettavampi, mutta silti yksinkertainen tapa havaita Y. enterocolitican kaltaiset bakteerit. Tutkimuksessa kehitettyjä menetelmiä voidaan hyödyntää elintarvikevälitteisten Yersinia – suvun bakteerien tarkemmassa tunnistamisessa, tartuntareittien selvittelyssä ja sitä kautta epidemioiden ennaltaehkäisyssä.