Biochemical and structural properties of Potato virus A VPg

The potato virus A (PVA) genome linked protein (VPg) is a multifunctional protein that takes part in vital infection cycle events such as replication and movement of the virus from cell to cell. VPg is attached to the 5´ end of the genome and is carried in the tip structure of the filamentous virus particle. VPg is also the last protein to be cleaved from the polyprotein. VPg interacts with several viral and host proteins and is phosphorylated at several positions. These features indicate a central role in virus epidemiology and a requirement for an efficient but flexible mechanism for switching between different functions. -- This study examines some of the key VPg functions in more detail. Mutations in the positively charged region from Ala38 to Lys44 affected the NTP binding, uridylylation, and in vitro translation inhibition activities of VPg, whereas in vivo translation inhibition was not affected. Some of the data generated in this study implicated the structural flexibility of the protein in functional activities. VPg lacks a rigid structure, which could allow it to adapt conformationally to different functions as needed. A major finding of this study is that PVA VPg belongs to the class of ´intrinsically disordered proteins´ (IDPs). IDPs are a novel protein class that has helped to explain the observed lack of structure. The existence of IDPs clearly shows that proteins can be functional and adapt a native fold without a rigid structure. Evidence for the intrinsic disorder of VPg was provided by CD spectroscopy, NMR, fluorescence spectroscopy, bioinformatic analysis, and limited proteolytic digestion. The structure of VPg resembles that of a molten globule-type protein and has a hydrophobic core domain. Approximately 50% of the protein is disordered and an α-helical stabilization of these regions has been hypothesized. Surprisingly, VPg structure was stabilized in the presence of anionic lipid vesicles. The stabilization was accompanied by a change in VPg structure and major morphological modifications of the vesicles, including a pronounced increase in the size and appearance of pore or plaque like formations on the vesicle surface. The most likely scenario seems to be an α-helical stabilization of VPg which induces formation of a pore or channel-like structure on the vesicle surface. The size increase is probably due to fusion or swelling of the vesicles. The latter hypothesis is supported by the evident disruption of the vesicles after prolonged incubation with VPg. A model describing the results is presented and discussed in relation to other known properties of the protein.

Rakenteettoman proteiinin rakenteet Klassinen malli proteiinin rakenteen ja toiminnan suhteesta yhdistää toimintaan tietyn vakaan kolmiulotteisen rakenteen. Viimeisten parin vuosikymmenen aikana tämä käsitys on alkanut muuttua, ja on selvinnyt, että proteiinin toiminnallisuus ei vaadi vakaata rakennetta. Päinvastoin, alkaa näyttää siltä että usean tyyppiset proteiinit hyötyvät löyhästä laskostumisesta, joka mahdollistaa rakenteen sopeutuvuuden tilanteen mukaan. Tutkimustiedon lisääntyessä näitä proteiineja on alettu kutsua sisäisesti rakenteettomiksi proteiineiksi (intrinsically disrordered proteins). Näyttäisi, että jopa puolet kaikista proteiinisekvensseistä saattaa koodata rakenteetonta aluetta. Rakenteettomuuden yleisyyden on arveltu selittyvän sen tuomilla eduilla. Se voi kasvattaa proteiinin vuorovaikutuspinta-alaa saranamaisten alueiden välityksellä tai muodostamalla paikallisen jatkuvassa liikkeessä olevan pinnan. Seurauksena proteiini voi omaksua useita erilaisia rakenteita sitoutumiskohteesta ja ympäröivistä olosuhteista riippuen. Lopputulemana proteiinin toiminnallinen monimuotoisuus lisääntyy ja yksi proteiini pystyy suoriutumaan lukuisista eri tehtävistä. Viruksilla ilmiö on melko tuntematon. Rakenteettomuuden voidaan kuitenkin olettaa olevan yleistä myös virusproteiineilla, sillä niiden on suoriuduttava useista hyvin erilaisista infektiosyklin vaiheista ja niihin liittyvistä biokemiallisista tapahtumista pienellä määrällä proteiineja. Monien virusproteiinien onkin osoitettu osallistuvan useisiin eri tehtäviin. Näin toimii myös monien virusten genomiin liitetty VPg -proteiini. Se vaikuttaa esimerkiksi viruksen liikkumiseen, genomin monistumiseen ja tumakuljetukseen. VPg on selkeästi osittain rakenteeton proteiini. Väitöskirjassa proteiinin rakenteettomuutta on tutkittu käyttäen potyvirus -sukuun kuuluvaa perunan A viruksen VPg:tä. Rakenteettomuuden lisäksi työssä näytettiin rakenteen vakautuminen sen sitoutuessa rasvahappoihin ja tarkkailtiin proteiinin eri toimintoja ja niiden suhdetta rakenteettomuuteen. Proteiinin sitoutuminen rasvahappokalvon pintaan näyttäisi johtavan myös reikämäisten rakenteiden syntymiseen ja lopulta kalvojen rakenteen hajoamiseen. Mekanismi voi liittyä merkittäviin infektiosyklin vaiheisiin, joissa virus muokkaa isäntäsolun kalvorakenteita omiin käyttötarkoituksiinsa. Tähän asti kokeet on suoritettu keinotekoisessa rasvahappoympäristössä ja jatkokokeissa ilmiö pyritään varmistamaan kasvin soluissa.